大豆磷脂对体外培养乳鼠神经细胞损伤保护作用的研究
作者：王翠瑶 张晓宏 马洪林
【摘要】 目的： 观察大豆磷脂脂质体（SPL）对谷氨酸所致培养乳鼠神经细胞损伤的保护作用。方法： 取新生大鼠（0～1d）大脑皮层神经细胞进行原代培养，8～10d后加入谷氨酸（Glu），造成神经细胞的损伤，SPL保护组在Glu损伤处理的同时加入不同浓度的大豆磷脂脂质体，测定乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的含量，观察谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性及大豆磷脂脂质体的保护作用。结果：加入谷氨酸后，神经细胞出现明显损伤性变化，培养上清液中LDH含量增加，细胞匀浆中MDA生成增加， SOD含量明显减少。大豆磷脂脂质体在0.2mg/ml～1.6mg/ml浓度时能显著减轻上述损伤性变化。结论：大豆磷脂脂质体对谷氨酸所致培养乳鼠神经细胞兴奋毒性损伤具有显著的保护作用，其机制可能与大豆磷脂脂质体抗脂质过氧化作用有关。
【关键词】 大豆磷脂； 脂质体； 谷氨酸； 神经细胞培养
目前谷氨酸的兴奋毒性作用于缺血性脑损害的研究最多，脑缺血时突触前谷氨酸释放增加，再摄取减少，导致NMDA受体过度兴奋，Ca2+大量内流，产生离子依赖性兴奋毒性。大豆磷脂脂质体是一种人工制备的生物膜，它可嵌入细胞膜，利用膜的液化使膜的流动性增强，从而保护细胞膜的完整性。国内有学者报道大豆磷脂能明显减轻脑缺血性损伤［1］，但大豆磷脂脂质体对谷氨酸造成体外培养的神经细胞兴奋毒损伤是否具有保护作用尚未见报道。我们利用谷氨酸产生兴奋毒性，对体外培养的神经细胞造成损伤，模拟体内脑缺血产生Glu对神经细胞造成的损伤，观察大豆磷脂脂质体浓度的累积对神经细胞损伤保护作用的关系，并探讨其可能的作用机制。
1 材料
1?1 动物0～1d的SD大鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供。
1?2 药物与试剂L?多聚赖氨酸和L?谷氨酸购于美国Sigma公司；高糖DMEM培养基、F12培养基和胰蛋白酶购于GIBCO公司；胎牛血清、马血清购于天津灏洋生物制品有限公司；盐酸阿糖胞苷(批号991201)购于上海华联制药有限公司；大豆磷脂购于北京清华紫光公司；乳酸脱氢酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、超氧化物歧化酶测试盒均购自南京建成生物工程研究所；其它所用试剂均为国产分析纯。
1?3 仪器HERA cell二氧化碳培养箱（德国GmbH公司）；OLYMPUS倒置显微镜（JAPAN OLYMPUS TOKYO）；DZF?6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；751紫外分光光度计（江苏金坛市医疗仪器厂)。
2 方法
2?1 大豆磷脂脂质体的制备与鉴定大豆磷脂脂质体的制备按本研究室建立的方法［2］,所制备的脂质体负染后透射电镜下观察为大小较均匀的单层脂质体，经IBAS图象处理系统测得其平均直径为85nm，属小脂质体。
2?2 新生乳鼠皮层神经细胞的原代培养参照Choi等［3］的方法,略加调整。无菌条件下，新生0～1ｄ的大鼠开颅取出大脑皮层放入预冷的DMEM培养基中，剔除软脑膜和血管, 剪碎置于0.125%胰蛋白酶中，37℃水浴消化30min后，加入等量完全培养基终止消化，1000r/min离心10min，弃上清，加入培养液反复吹打，200目尼龙网过滤后计数，调细胞浓度1×106/ml，接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，每孔1ml，37℃、5%CO2孵箱中培养。接种48h后全量换液，并加入5μmol/L的阿糖胞苷以抑制非神经元的增殖，以后每周半量换液3次。
2?3 实验分组神经细胞培养8～10d后分正常对照组、损伤组和SPL保护组。损伤组吸去原培养液，无Mg2+ Earle’s液(mmol/L：NaCl 142.6，KCl 5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 1.0，葡萄糖 5.6，HEPES 2.38，pH 7.4)洗2遍，每孔加入含Glu终浓度1×10-4mol/Ｌ的无Mg2+Earle’s液1ml，3h后用DMEM培养基洗去Glu，再换用无血清的DMEM培养基，置37℃、5%CO2培养箱中继续培养24ｈ；正常对照组不加Glu，SPL保护组在Glu损伤处理的同时加入不同浓度（0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml）的大豆磷脂脂质体，其余处理同上。
2?4 LDH的测定各组细胞加处理因素后，收集培养上清液，参照试剂盒说明书测定培养液中LDH活性。
2?5 神经细胞MDA、SOD的测定各组细胞加处理因素后，去除原培养液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1mol/L PBS，0.05mmol/L EDTA（pH 8.0）1mL，再加入1％Triton?X 100 50μL，将24孔培养板置振荡器振荡1min使细胞溶解，加入25％H3PO4100μl以沉淀蛋白，于4℃离心1h，取上清液按试剂盒说明书测定MDA含量、SOD活性。蛋白质定量用考马斯亮兰试剂盒测定。
2?6 统计学处理多样本均数检验采用方差分析的方法，方差分析差异有显著性后再进行样本的两两比较（Q检验）。
3 结果
3?1 培养神经细胞的形态学变化正常对照组新生乳鼠皮层神经细胞培养8～10d后，镜下观察，神经细胞清晰可见，多数呈多极形或锥形，光晕明显，突起交织成网状，核不可见。损伤组加入谷氨酸后细胞胞体光晕消失，突起回缩，胞体折光性下降，核易见，部分胞体溶解。而SPL保护各组细胞更接近正常形态，说明SPL能明显改善神经细胞谷氨酸损伤的形态学变化。
3?2 培养上清液中LDH的变化与正常对照组相比，损伤组培养上清液中LDH漏出量明显增加(P＜0.01)；而SPL保护各组与损伤组相比，LDH漏出量均明显下降，且呈剂量依赖性，但当剂量达到一定浓度（1.6mg/ml）时，SPL保护作用不再随着浓度的升高而增强，反而有所下降，见表1。
表1 培养上清液中LDH的变化（略）
注：* 与正常对照组比较，P＜0.01；** 与Glu损伤组比较，P＜0.01；# 与前一保护组比较，P＜0.05 。
3?3 培养神经细胞MDA含量及SOD活性的变化损伤组神经细胞匀浆中MDA含量显著增加，SOD活性显著降低。与损伤组相比，SPL保护各组随着剂量的增加，均可显著降低MDA的含量，同时升高SOD活性，并呈剂量依赖性；但当SPL达到一定浓度（1.6mg/ml）时，保护作用不再随着浓度的升高而增高，见表2。
表2 培养神经细胞MDA及SOD的变化（略）
注：同表1。
4 讨论
Glu是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸，在维持神经细胞正常信号传导中起着重要的作用。但Glu大量释放，激活Glu受体，就会引起一系列病理反应，导致神经细胞变性坏死。谷氨酸在细胞外液中的蓄积在缺血性脑损伤中发挥着重要作用。研究表明［4～6］，脑缺血后谷氨酸过度释放，激活了NMDA受体，引起Ca2+大量内流，细胞内过多的Ca2+激活磷脂酶A2触发花生四烯酸代谢瀑布，产生氧自由基，花生四烯酸和氧自由基又促使神经细胞释放谷氨酸，形成恶性循环。自由基及其引发的脂质过氧化对生物膜脂质的破坏是神经元死亡的重要诱因。磷脂是生物膜的重要组成成分，SPL可提供膜磷脂并和细胞膜间脂质交换，进而稳定细胞膜的结构和功能。从表1、2中的结果可见，培养的神经细胞受到Glu损伤后，LDH漏出率增加，膜脂质过氧化产物MDA生成增多，而SOD活性下降。SPL能明显改善神经细胞谷氨酸损伤的形态学变化，显著减少LDH的漏出量，减少MDA的生成，提高SOD活性，表现出较强的神经细胞保护作用。由此认为，SPL对谷氨酸所致神经细胞兴奋毒性损伤的保护作用机制能为大豆磷脂作为膜脂质的供体，将其制成脂质体形式以融合、吸附、脂质交换等方式与细胞相互作用并和细胞膜间脂质交换，从而将脂质体某些成分转移至细胞中，以修补细胞膜脂质成分，稳定细胞膜的结构和功能。此外，可以减少膜脂质过氧化产物生成，提高抗氧化物质含量，阻断“脂质三联体”效应。
【】
1 石富成,周景春,孟东娅，等.大豆磷脂对脑梗死作用的研究. 中华医学杂志,2001;81(21):1301～1303?
2 刘超，肖建英，王浩，等. 大豆磷脂对羟自由基引起培养心肌细胞损伤的保护作用?锦州医学院学报， 2004,25(5):4～6?
3 Choi DW,Kolh JY. Quantitive determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase effux assay. J Neurosci Methods,1987，5:83～90?
4 Choi DW.Calcium:still center?stage in hypoxid?ischemic neuronal death. Trends Neurosci,1995，18:58～60?
5 Cao G,Minnami M,Pei W.Intracellular bax translocation after transient cerebral ischemia:implications for a role of the mitochondrial apoptotic signaling pathway in ischemic neuronal death. J Cereb Blood Flow Metab,2001，21(4):321～333?
6 Lewen A,Matz P,Chan PH.Free radical pathway in CNS injury. J Neurotrauma, 2000，17(10):871～890?
