牛视网膜毛细血管周细胞的选择性培养
作者：杨建华 段俊国 周春阳
【摘要】 目的：探讨牛视网膜毛细血管周细胞（pericyte,PC）的体外选择性培养方法。方法：结合视网膜微血管的消化分离，采用含200mL/L胎牛血清的DMEM培养基选择性培养PC，以免疫组织化学染色进行细胞鉴定。通过相差倒置显微镜观察原代PC的形态、生长特性以及与血管碎片之间的关系。 结果：通过选择性培养获得的PC的纯度达到98%以上，并能连续传代。PC早期多散布在距血管碎片稍远处，形状不规则。结论：选择性培养的应用可获得较高纯度的PC，简单且具有良好的重复性，无需额外步骤来除杂。
【关键词】 细胞培养 视网膜 毛细血管周细胞
Selective culturing of bovine retinal capillary pericytes
Abstract AIM: To explore the selective culture method of bovine retinal capillary pericyte in vitro. METHODS: Using 20% DMEM, bovine retinal capillary pericyte was cultured in vitro with digesting culture method of retinal microvasculature, and the cultured cells were identified by immunohistochemical stain. The pericyte cells morphous, growth character and relationship between vascular fragment and the cells cultured in vitro were observed by using inverted microscope.RESULTS: The purity of the cells cultured in vitro was higher than 98%, and the cells could be continued serially. The cells cultured early were dispersed from vascular fragment with irregular shape.CONCLUSION: Higher purity retinal capillary pericyte cultured in vitro can be obtained through the selective culture method which is simple and repeatable without any other procedures.
· KEYWORDS: cell culture; retina; retinal capillary pericyte
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病所致微血管病变的主要并发症之一，DR的发病率随着糖尿病病程的增加而增加，目前 DR是发达国家最重要的四大致盲眼病之一，且为失明原因之首[1]。多年来，国内外许多学者对DR进行了大量实验性和应用性研究，取得了一定的进展，但是DR确切的发病机制还不清楚，目前强调为多因素协同作用的结果。随着细胞生物学和分子生物学在眼科领域的不断渗透，逐渐认识到DR是一种具有特异性改变的眼底病变，视网膜毛细血管周细胞（pericyte，PC）的选择性减少甚至消失是DR最早期的病理改变之一，在DR的形成中至关重要。周细胞消失损害了视网膜毛细血管的完整性，使血—视网膜屏障破坏，最终导致一系列眼底并发症。周细胞具有调节内皮细胞增殖、新生血管生长、毛细血管血流、通透性及稳定性等多种功能。近年来大量的研究表明，周细胞可通过多种途径参与糖尿病视网膜病变的发生、，尤其与早期糖尿病视网膜病变密切相关。而阐明其相互作用的具体机制对最终找到防治糖尿病视网膜病变的新方法至关重要。因此周细胞已成为研究在各种生理、病理以及药物作用等情况下，作为微循环系统的一部分发生改变的重要观察对象。过去，对视网膜微血管PC培养的方法虽然较多，但操作复杂，花费较大。我们综合前人的经验，建立了一种选择性培养视网膜微血管PC的较简单方法，并获得成功如下。
1材料和方法
1.1材料 牛视网膜毛细血管周细胞来源于1日龄小牛（由成都锦江生物制品厂提供），处死后10min以内摘取眼球。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）干粉、Ⅲ型胶原酶粉、胰蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；小牛血清（华西生化制品厂）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；二甲基亚砜（Sigma公司）。HBO50型倒置相差显微镜（德国Zeiss公司）；超净工作台（苏州医疗器械厂）； MCO-150A型二氧化碳培养箱（日本三洋公司）；PHS-3C型精密PH计（上海雷磁仪器厂）；自动平衡离心机（北京医用仪器厂）；超低温冰箱（日本三洋公司）；120目筛网（上海医疗器械厂）；酶联免疫检测仪（Beckman公司Array 360）。
1.2方法 牛视网膜毛细血管周细胞体外培养：参照Gillies 等[2]的方法并加以改进，分离培养原代的视网膜毛细血管周细胞。取新鲜牛眼，4h内在无菌条件下，从角巩膜缘后3mm处环行剖开眼球，弃眼前节，小心去除玻璃体，剥离视网膜，用PBS液清洗，用剪刀剪碎，加入2g/L胶原酶适量，37℃，消化40min，120目筛网过滤，去除杂细胞及组织碎片， 加入小牛血清终止消化 ，离心10min（1 000r/min），弃上清液，加入200g/L DMEM培养液吹打制成细胞悬液，接种入50cm2培养瓶中，37℃，50ml/L CO2培养箱中培养，1～2d后更换培养液，以后视细胞生长情况每3～4d更换培养液。3wk以后，当细胞达到接近融合状态时，加入2.5g/L胰蛋白酶消化至细胞形态开始变圆，然后加入培养液终止消化，弯头吸管轻柔吹打使贴壁生长的周细胞进入培养液中，离心10min（1 000r/min），弃上清液，加入200g/L DMEM培养液吹打制成细胞悬液，调整密度为5×107/L，分瓶，放入37℃，50mL/L CO2培养箱中培养，以后视细胞生长情况每3～4d更换培养液。原代细胞初始分离和鉴定主要根据细胞形态，在相差倒置显微镜下观察原代PC的形态、生长特性以及与血管碎片之间的关系。用ACTIN（鼠抗人横纹肌肌动蛋白）和Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色进行鉴定，Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色显示周细胞胞浆内特异性蓝紫色着色为阳性表达。分别取原代培养9d近融合的PC，消化后制成密度为3×107/L的单细胞悬液，将其接种于96孔板中，每孔接种100μL，每3d换液1次。分别于接种后1,2,4,6,8,10,12d，加入5g/L MTT溶液20μL后37℃下培养4h，然后弃除孔内上清夜，每孔加入2g/L二甲基亚砜（DMSO）150μL振荡5min，在酶联免疫检测仪上以590nm波长测定各孔吸光度A 值。以时间为横轴，A 值为纵轴绘制细胞生长曲线。
2结果
2.1原代周细胞的生长状况 用胶原酶消化视网膜血管后分离周细胞，在倒置相差显微镜下观察见大多为单个圆形细胞，大小均一，中央有一圆形不透光区域为细胞核。2wk后大部分细胞贴壁变扁平，成多角形态，伸出较多突起，并逐渐形成集落生长。3wk后，细胞铺满，致密排列，重叠多层（图1A）。传代后周细胞在4h内开始贴壁（图1B），细胞由圆形伸展为多角形，大多呈多角形，伸出较多突起。3～4d后细胞融合成密集的单层细胞，排列成不规则栅栏状。1wk后，细胞铺满，致密排列，重叠多层（图1C）。
2.2 周细胞的鉴定和增殖 ATIN免疫组织化学染色显示周细胞胞质内不着色。Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色显示周细胞胞质内特异性蓝紫色着色。阳性率为100%（图1D）。 采用该方法获得的PC均能传代培养。而且，传代培养后细胞增殖速度均较原代培养时明显增快，4～5d即进入对数生长期,直到9～10d才进入平台期(图2)。
图 1 A 周细胞原代，图中黑色团块为死亡的杂细胞 200× ；B 接种4小时的周细胞第二代，周细胞开始贴壁、变形 400× ；C 融合的周细胞第二代 200×；D 周细胞鉴定
图2 视网膜毛细血管周细胞生长曲线（MTT法）
3讨论
视网膜毛细血管周细胞的分离和纯化是一个较为复杂的操作过程，以往多采用匀浆、逐级过滤、消化分离法[3,4]，我们经过改进，用Ⅲ型胶原酶消化40min后，仅用120μm的尼龙筛过滤1次除杂。经鉴定，在周细胞分离、培养过程中既未发现内皮细胞的掺杂，也未见平滑肌细胞的生长。我们成功的建立了分离和培养视网膜毛细血管周细胞的有效方法。在周细胞的体外培养实验中获取纯净的周细胞是实验的关键所在[5]。在PC细胞取材时，若操作不慎极易混进成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞和其它杂细胞。成纤维细胞分裂增殖较快，少量成纤维细胞混入即可成为优势细胞，抑制周细胞的分裂增殖；若混入较多红细胞，分裂增殖快的红细胞也会影响周细胞的分裂增殖，甚至使周细胞全部死亡，使实验无法进行。要保证周细胞的纯度，应注意：牛眼取下后及时在750g/L酒精中浸泡2min，可使视网膜容易剥脱，避免混入视网膜色素上皮细胞及成纤维细胞；剖开眼球的位置应在角巩膜缘后3mm处，视网膜将随玻璃体的脱出完整剥离；我们还发现，胶原酶消化时间越长，内皮细胞及平滑肌细胞等杂质细胞污染越多，周细胞活力越下降，因此，以4倍体积的胶原酶Ⅲ消化40~60min为宜。消化后一定要用120μm的尼龙筛过滤1次，以除去杂细胞和组织碎片。我们用庆大霉素代替Betadine对实验眼球进行消毒，效果良好，未发现毒副作用，而且庆大霉素较Betadine易得，价廉，为视网膜毛细血管周细胞的培养提供了极大的方便。
DMEM含有丰富的维生素、氨基酸，各种营养成分比例适当，适合细胞生长需要，而广泛应用于细胞培养。在配置DMEM培养液时应注意将pH值调至7.0±，微孔滤膜过滤后pH值将升高0.2～0.4，使培养液的最终pH值为7.2～7.4。为保持pH值的稳定，在培养液中加入适量HEPES。原代培养宜选用胎牛血清，浓度为200ml/L，胎牛血清中含有促细胞贴壁的成分，有助于周细胞贴壁生长。在细胞已适应体外培养环境后，传代培养可选用小牛血清（nenwbom calfserum,NCS），浓度为100～200ml/L。
【】
1李秀钧.糖尿病研究进展-第16届国际糖尿病联盟大会纪要.中华内分泌代谢杂志,1998;14(2):72-74
2 Gillies MC, Tao S. High glucose inhibits retinal capillary pericyte contractility in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1993;34:3396-3399
3 Burney SM, Massicotte SJ, Heru N. Rrtinal vascular endothelial cells and pericytes: differential growth characteristics in vitro . Invest Ophthalmol Vis Sci ,1983;24:470-480
4 Gitlin JD, Patricia A. Culture of retinal cells using selective growth media. Micro VAX Res ,1983;26:74-80
5赵平,于华军.基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在糖尿病小鼠视网膜组织中的表达.国际眼科杂志,2004;4(4):610-614
