5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡研究
【摘要】 ［目的］ 探讨5-氮- 2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）诱导膀胱癌EJ细胞凋亡机制。［方法］ 以不同浓度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌EJ细胞，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖程度，原位凋亡细胞检测技术(TUNEL)和流式细胞术(FCM)检测5-Aza-CdR对膀胱癌EJ细胞凋亡和细胞周期的影响。［结果］ EJ细胞加入不同浓度的5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml），与对照组相比各组EJ细胞增长速度减慢。与对照组相比，不同浓度的各组 5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml）可以显著降低EJ细胞的增殖比和增高EJ细胞的凋亡指数(P<0.05)，且与5-Aza-CdR呈浓度依赖关系(P<0.05)；不同浓度的5-Aza-CdR作用EJ细胞后G0/G1期细胞明显增加(P<0.05)。［结论］ 5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡并使EJ细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖。
【关键词】 5-氮-2′-脱氧胞苷 膀胱肿瘤 凋亡
Study on EJ Cells’ Apoptosis Induced by 5-Aza-2′-decxycytidine（5-Aza-CdR）
5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-decxycytidine，5-Aza-CdR）是一种特异性甲基转移酶抑制剂，通过去甲基化作用可使多种 CpG 岛高甲基化的抑癌基因重新表达，恢复抑癌功能。但5-氮-2′-脱氧胞苷是否可以通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤尚少见报道。本研究以膀胱癌EJ细胞株为研究对象，以不同浓度的5-Aza-CdR作用于EJ细胞，观察5-Aza-CdR对EJ细胞凋亡和细胞周期的影响，为膀胱癌的治疗提供新的线索。
1 材料与方法
1.1 材 料
膀胱癌细胞株EJ细胞购自北京大学泌尿外科研究所。5-Aza-CdR购自Sigma公司；PRMI1640培养基、新生牛血清购自GIBCO公司；原位凋亡细胞检测技术（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）试剂盒购自武汉博士德公司。其它试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
细胞培养：将复苏的EJ细胞培养于含10%新生牛血清的PRMI1640培养基中，37°C，100%湿度，5%CO2，95%空气，每24h换液1次。
四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖程度: 将培养的EJ细胞按随机原则分为对照组与实验组。当细胞达到亚融合状态时，常规制成单细胞悬液，以5000个/孔将细胞接种于96孔板，每组4个平行孔。培养24h后，4℃冰箱2h，使细胞同步化。弃去培养液每孔按分组要求分别加入不同量的5-Aza-CdR(1mg/ml)及无血清培养液，使各孔的终体积均为200μl，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml,每一浓度重复4孔。37℃, 5%CO2，培养48h后弃去培养液，各孔加入MTT20μl(5mg/ml)，37℃孵箱4h；各孔加入二甲基亚砜150μl，避光振荡10min， 酶标仪640nm波长测定各孔吸光值，以增殖比（proliferation ratio）表示增殖程度（增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值×100%）。
原位凋亡细胞检测技术检测细胞凋亡：采用六孔板盖玻片培养法，调整细胞密度至5×104/孔，培养24h后，吸弃培养液，每孔按分组要求分别加入不同量的5-Aza-CdR和无血清培养液，使各孔的终体积均为2ml，每组4个平行孔，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。37℃，5%CO2，培养48h后，以4%多聚甲醛固定，按原位凋亡细胞检测试剂盒中说明书进行操作，细胞核呈棕黄色染色判定为凋亡细胞。光镜下随机选取10个视野计数1000个细胞。凋亡指数（apoptotic index，AI）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞周期时相变化：用培养瓶培养细胞，按照随机分组原则，将培养的细胞分为5组：空白对照组加入2ml无血清培养液，另4组加入2ml 5-Aza-CdR(1mg/ml)，每组4个平行孔，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。细胞经24h培养后，胰酶消化，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)避光染色，用FACSort型流式细胞仪进行细胞周期的分析。
1.3 统计分析
采用SPSS10.0软件包进行统计分析，方差分析组间差异（t检验）。
2 结 果
2.1 MTT法检测细胞增殖程度
5-Aza-CdR对EJ细胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，与空白对照组相比，不同浓度 5-Aza-CdR组EJ细胞增殖比差异有显著性(P<0.05)，且与5-Aza-CdR呈浓度依赖关系(P<0.05)。见表1。
2.2 原位凋亡细胞检测技术检测细胞凋亡
EJ细胞培养48h后，实验组细胞于镜下可见较多胞核染成棕黄色的凋亡细胞，实验组EJ细胞的凋亡指数与空白对照组相比差异有显著性(P<0.05)，且与5-Aza-CdR呈浓度依赖关系(P<0.05)。见表1。
2.3 流式细胞术检测细胞周期时相变化
EJ细胞培养24h后，用不同浓度的5-Aza-CdR作用EJ细胞后，流式细胞仪进行细胞周期的分析显示G0/G1期细胞明显增加，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。见表2。
3 讨 论
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制。该机制的异化可导致基因表达的异常及基因组稳定性的降低, 继而促进肿瘤发生和。启动子CpG岛的高甲基化已被认为是与遗传性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在肿瘤中失活的分子生物学机制。目前的研究认为,大多数抑癌基因的失活是由于启动子区域高甲基化所致[1]。Dreijerink等[2]在研究中发现通过5-Aza-CdR脱甲基处理，可激活RASSF1A的再表达, 并可抑制含有正常的VHL基因表达的肿瘤细胞系在塑料盘和非贴璧的软琼脂上的生长。
本研究选用 5-Aza-CdR 作为去甲基化制剂处理膀胱癌细胞株，其为一种嘧啶类似物，在与复制过程中的DNA分子结合时该制剂可与 DNA 甲基转移酶Ⅰ形成一共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，从而导致形成低甲基化的子链，实现去甲基化功能[3]。研究结果表明5-Aza-CdR对EJ细胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，与空白对照组相比，不同浓度 5-Aza-CdR组EJ细胞增殖比差异显著，且与5-Aza-CdR呈浓度依赖关系。
为了探讨5-Aza-CdR的作用机制，我们应用原位凋亡检测技术发现5-Aza-CdR能够促进体外培养的EJ细胞凋亡，且凋亡指数与5-Aza-CdR浓度呈明显正相关。5-Aza-CdR诱导细胞凋亡的机制目前尚不清楚，有学者认为5-Aza-CdR可能是通过对RASSF1A基因的再表达，从而对肿瘤细胞的生长进行抑制[4]，活化的RAS癌蛋白在细胞中也许起到了双重作用，通过效应蛋白，一方面促进细胞生长和转化；另一方面它又促进细胞的凋亡、衰老、坏死和终末分化。而RASSF1基因可能就是编码RAS后一种作用的特有的效应蛋白，它的失活破坏了RAS的平衡作用，导致了细胞的恶性转换[5]。也有学者认为，5-Aza-CdR作用于肿瘤细胞使之产生凋亡可能是该类药物的另一种作用机制，目前有关 5-Aza-CdR对肿瘤的作用机制日益受到重视，但至今仍未确定其具体作用。本研究发现EJ细胞培养24h后，用不同浓度的5-Aza-CdR作用EJ细胞后G0/G1期细胞明显增加，与对照组相比差异有显著性。Tang等[6]在大肠癌的研究中也得到相同结论。我们认为5-Aza-CdR通过使RASSF1A、p16、p21等抑癌基因的再表达，通过对Rb家族的细胞周期检查点的作用而诱导细胞周期的停滞。有研究中发现RASSF1A可以抑制CyclinD1的积聚而控制细胞周期G1期向S期转变[7]，因此5-Aza-CdR在细胞周期的G0/G1期调控细胞的增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期进展而对EJ细胞产生直接抑制作用。
5-Aza-CdR应用于肿瘤已证实在复发性和顽固性急性白血病和慢性髓性白血病危象时具明显疗效[8]。Gagnon等[9]发现5-Aza-CdR与组蛋白乙酰转移酶抑制剂在乳腺癌体外抗癌起协同作用，这种协同作用可提高肿瘤对化疗药物的敏感性，并可减少5-Aza-CdR的应用剂量，减少大剂量带来的毒副作用，同时加强抑制肿瘤的功能。5-Aza-CdR诱导肿瘤细胞凋亡应用于肿瘤治疗，为进一步研究膀胱肿瘤的治疗提供了新的思路，值得进一步深入研究。
【】
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