长春新碱致神经病理性疼痛模型中胶质细胞及IL?1β、GDNF表达的变化
【摘要】 目的 研究长春新碱致神经病理性疼痛中胶质细胞是否活化及其作用机制。方法 大鼠腹腔内重复注射长春新碱建立模型。免疫化检测脑及脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞特异性活化标志物GFAP和OX?42的表达。RT?PCR测定IL?1β和GDNF mRNA在脊髓腰段的表达。结果 给药大鼠分别在第8 天和第5天出现机械痛阈降低和热痛耐受时间降低。给药大鼠中脑导水管周围灰质及脊髓灰质中见明显胶质细胞的活化。给药组较对照组IL?1β表达增加，GDNF表达减少。结论 胶质细胞在长春新碱致神经病理性疼痛中明显活化。IL?1β及GDNF与长春新碱引起的神经病理性疼痛有关。
【关键词】 长春新碱；疼痛；胶质细胞；胶质细胞源性神经营养因子
Activation of Glial Cells and Expression Change of IL?1β,GDNF in Vincristine?induced Neuropathic Pain
Abstract：Objective Glial cells play essential roles in creation and maintenance of pain state. This study was designed to explore the activation of glial cells in vincristine?induced neuropathic pain, and to find how glial cells influence pain threshold.Methods We adapted a model by using repeated intraperitoned injection of vincristine. By immunohistochchemical technique, the expression of specific activation markers of astrocytes and microglials, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and OX?42 respectively, were examined in brain and lumbar intumescentia. Using RT?PCR analysis techniques, the expression of interleukine?1β(IL?1β) and glial cell line?derived neurotrophic factor (GDNF) in lumbar intumescentia were tested.Results Mechanical hyperalgsia appeared on the 8th day and thermal hyperalgsia appeared on the 5th day of vincristine treatment. Glial cells were obviously active in periaquenductal gray and spinal gray. IL?1β expression was increased in chemotherapy group, while GDNF was higher in control group.Conclusion Glial cells were active in Vincristine?induced neuropathic pain. The change of expression of IL?1βand GDNF were involved in neuropathic pain evoked by vincristine.
Key words：Vincristine; Pain; Glial cells; GDNF
0 引言
长春新碱是常用抗肿瘤药物，也是引起神经病理性疼痛的常见药物之一。近年发现胶质细胞在神经病理性疼痛中起重要作用 [1]。长春新碱引起的神经病理性疼痛中是否有胶质细胞的参与尚不清楚。本研究建立长春新碱致神经病理性疼痛大鼠模型，检测其脑和脊髓腰段胶质细胞的活化，并检测脊髓腰段 IL?1β、胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line?derived neurotrophic factor, GDNF)的表达变化。探讨长春新碱致神经病理性疼痛的机制，为寻求新的策略提供依据。
1 材料和方法
1．1 分组及建立动物模型
雄性Sprague?Dwley(SD)大鼠20只，体重160g左右，湖北中医学院实验动物中心，医动字第19－052号。UGO Basile公司37400型Dynamic Planter 机械测痛仪，37300型热平板试验仪。
大鼠以随机数字法分为2组，测基础体重、机械痛阈和热痛耐受时间。以第1次注射长春新碱为第1天，给药组第1～5天和第8～12天腹腔注射0.1mg·(kg·d)-1长春新碱注射液（以生理盐水稀释至1ml），对照组注射1ml生理盐水。分别于第3、5、8、10、12天测大鼠体重、机械痛阈及热痛耐受时间，同时观察大鼠运动、饮食及脱毛等情况。测机械痛阈及热痛耐受时间时，先将大鼠置测试仪上10～15min待其安静，两次测定间隔5min，左右足各重复3次，取平均值。
1．2 免疫组织化学检测胶质细胞活化
胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)多克隆抗体购自Neuromarker公司，1∶100稀释。小胶质细胞标志物OX?42(CR3, CD11b)单克隆抗体购自Serotec公司，1∶50稀释。
第12天取大鼠脑部及脊髓腰膨大处（留0.5cm提取RNA）。常规方法制成厚30μm冰冻切片，常规免疫组化SP法检测GFAP和OX?42的表达。光镜下检测棕黄色DAB染色阳性细胞。
结果判断：按Colburn等 [2]所述活化分级方法评分。评分（·）：胶质细胞无活化，胶质细胞分支好。评分（+）：胶质细胞仍分支但活化标志物表达增加，细胞密度增加。评分（++）：胶质细胞分支减少，活化标志物表达明显增加，细胞有时重叠。评分（+++）：胶质细胞分支粗短，活化标志物明显增加，细胞重叠明显。+～+++ 均为阳性。
1．3 RT?PCR检测脊髓腰段中GDNF mRNA水平表达
Trizol 试剂盒购自华舜生物公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR试剂盒购自Promega公司。
处死大鼠后迅速取腰膨大处约0.5cm 脊髓加入匀浆器，RNA抽提说明书提取总RNA。取2μg总RNA，参考RT试剂盒说明合成cDNA。
内参照β?actin上游引物：5’?aagatttggcaccacactttctac?3’ ，下游引物：5’?acacttcatgatggaattgaatgt?3’； IL1?β上游引物：5’?TGATGTTCCCATTAGACAGC?3，下游引物：5’?GAGGTGCTGATGTACCAGTT?3’；GDNF上游引物：5’?CAGCATATGTCACCAGATAAACAAGCGGCGGCA?CT?3’，下游引物：5’?CAGGGATCCGGGTCAGATACATCCACACCGTTTAGC?3’，均由博亚生物公司合成。以1μl cDNA为模板，常规PCR 50μl体系反应。产物在溴乙锭处理的琼脂糖凝胶中电泳，将目的条带与内参照β?actin条带的吸光度比值作为其相对表达量，重复3次。
1．4 统计学方法
用SPSS11.0软件进行组间t检验。
2 结果
2．1 长春新碱对大鼠一般情况的影响
大鼠未出现扭体，运动失常，脱毛等。给药组中有3只大鼠出现腹泻并有4只大鼠死亡，对照组大鼠未见异常。给药组和对照组大鼠基础平均体重分别为(156.3±4.6)g和(160.6±5.4)g，无显著性差异(P=0.553)。给药组体重增长缓慢，至第10天，给药组与对照组体重差异具有显著性(P＝0.038)。
2．2 机械痛阈和热痛耐受时间改变
给药组与对照组后肢基础平均机械痛阈及后肢基础平均热痛耐受时间均无显著性差异。给药组与对照组至第8天机械痛阈差异开始具有显著性，至第12天两组之间差异最大，分别为(25.1±4.6)g和(38.3±2.0)g ，P＝0.001，给药组较对照组痛阈降低35%,见图1A。两组热痛耐受时间在第5天差异具有显著性，第8天差异达最大(P＝0.001)，第12天时两组差异消失，见图1B。
2.3 胶质细胞的活化
给药组大鼠中脑导水管周围灰质及脊髓背角可见分别以GFAP和OX?42标记的活化星形胶质细胞和小胶质细胞，胶质细胞分支减少，活化标志物表达明显增加，细胞有时重叠，活化评分均达（++），对照组活化评分均为（·）。在脊髓中活化胶质细胞分布于整个脊髓灰质，主要分布在背角第Ⅰ～Ⅱ层,见图2。
2.4 IL?1β与GDNF在脊髓腰段的表达变化
给药组与对照组IL?1β与β?actin条带吸光度比值分别为1.35和1.01，给药组IL?1β表达增高。GDNF条带与内参照β?actin条带的吸光度比值分别为1.76和1.20，给药组表达降低。重复3次结果相同，见图3。
3 讨论
本模型符合神经病理性疼痛的基本特征。在神经病理情况下，痛觉产生与刺激时间和强度相关性消失，甚至在没有刺激的情况下也产生痛觉（如幻肢痛），这类疼痛称为神经病理性疼痛。临床常见引起神经损伤的药物主要有长春碱类、铂类及紫杉醇类药物，均可引起神经病理性疼痛。长春新碱半衰期2.37h，然而临床可见患者停药后数月至数年仍有疼痛。本模型参照Weng等 [3]所述方法建立长春新碱致神经病理性疼痛模型。给药组痛阈值较对照组显著减少，较小刺激强度产生了痛觉，见图1，即痛觉与刺激强度的相关性降低，符合神经病理性疼痛的基本特征。
胶质细胞参与了长春新碱致神经病理性疼痛，提示这类疼痛存在中枢敏化机制。长春新碱可导致指趾末端的麻木感、刺痛感，但很少表现为中枢神经受损的症状。目前，关于长春新碱致神经病理性疼痛的机制尚存在争议。长春新碱可使神经系统发生脱髓鞘改变；且其抗肿瘤机制是对肿瘤细胞微丝微管的干扰，故学者推测其机制是干扰神经的轴浆运输。但神经元大多数情况下处于非有丝分裂状态，微丝微管并不活跃；某些药物作用于微管，但并不产生相似的神经毒性症状。因此，轴浆运输的破坏不能完全解释其机制。近来发现原来被视作支持细胞的神经胶质细胞在神经病理性疼痛中起重要作用。Garrison等 [4]率先观察到星形胶质细胞在神经病理性疼痛大鼠模型的脊髓背角活化，并且随疼痛增加活化增加。胶质细胞仅分布在中枢，故胶质细胞活化被认为是神经病理性疼痛中枢兴奋性增高的机制之一。本实验中胶质细胞活化，提示长春新碱引起的神经损伤临床表现在外周，也存在胶质细胞中枢调节作用。从胶质细胞活化部位看，这种调节不仅发生在脊髓水平，也在脑水平。
胶质细胞活化后使前致炎因子释放，包括IL?1β、 IL?6、 TNF?α等，后者又激活胶质细胞和神经元，产生疼痛。这是较为认可的胶质细胞作用机制。本实验中给药组IL?1β表达增加，也说明了这一点。
GDNF与长春新碱引起的神经病理性疼痛有关。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是1993年Lin等从大鼠胶质细胞系中纯化的神经营养因子，它可以修复神经损伤并和疼痛有关。Boucher等 [5]发现GDNF可保护坐骨神经部分结扎（PSL）及脊神经结扎（SNL）两种神经病理性疼痛模型中的神经损伤，减轻疼痛；而给予NGF及NT3则未起到效果。有作者假设，神经病理性疼痛中GDNF较NGF与疼痛的关系更密切 [6]。本研究中，药物组脊髓背角GDNF表达降低，提示GDNF与化疗引起的神经病理性疼痛有关，GDNF可能是化疗引起的神经损伤中起神经修复作用的重要神经因子。但本模型中，GDNF的分泌来源和部位需要进一步实验定位。
综上所述，长春新碱引起的神经病理性疼痛中，胶质细胞活化，这提示中枢敏化是这种疼痛的产生机制之一。其作用可能与胶质细胞释放炎性因子IL?1β增加及脊髓背角GDNF减少有关。(本文图2见插页)
【】
［1］Wieseler?Frank J, Maier SF, Watkins LR. Glial activation and pathological pain［J］. Neurochem Int, 2004,45(2?3):389?395.
［2］Colburn RW, DeLeo JA, Rickman AJ, et al.Dissociation of microglial activation and neuropathic pain behaviors following peripheral nerve injury in the rat ［J］．J Neuroimmunol, 1997, 79(2):163?175.
［3］Weng HR, Cordella JV, Dougherty PM. Changes in sensory processing in the spinal dorsal horn. accompany vincristine?induced hyperalgesia and allodynia［J］．Pain, 2003,103 (1?2): 131?138.
［4］Garrison CJ, Dougherty PM, Carlton SM. GFAP expression in lumbar spinal cord of naive and neuropathic rats treated with MK?801 ［J］. Exp Neurol, 1994,129(2): 237?243.
［5］Boucher TJ, Okuse K, Bennett DL. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states ［J］. Science, 2000,290(5489):124?127.
［6］Snider WD,Mc Mahon SB. Tackling pain at the source:new ideas about nociceptors［J］. Neuron, 1998,20(4):629?632.
