Skp2、p27在骨肉瘤中的表达及其临床意义

              作者：张劲松，杨述华，陈述伟，吴强

【摘要】  目的 探讨骨肉瘤中Skp2和p27蛋白的表达与患者临床病理和预后的关系以及两种蛋白之间的相关性。方法 用免疫组织化学SP法检测16例骨软骨瘤和48例骨肉瘤组织中Skp2和p27蛋白的表达情况。结果 Skp2蛋白在骨软骨瘤中的表达均为阴性，而在骨肉瘤中的表达阳性率为43.75%（21/48），后者的阳性率显著高于前者(P<0.01)。Skp2蛋白表达与临床分期、肺转移及分化程度显著正相关(P<0.05)。p27蛋白在骨软骨瘤、骨肉瘤中阳性率分别为81.25%(13/16)、47.92%(23/48)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。p27蛋白表达与临床分期、肺转移及分化程度呈负相关(P<0.05)。Skp2蛋白在骨肉瘤中表达与p27蛋白呈负相关(P<0.05)。结论 Skp2可能通过对细胞周期抑制因子p27蛋白的降解而参与骨肉瘤的发生、，联合检测Skp2及p27蛋白的表达对骨肉瘤患者的早期诊断，判定恶性程度及预后具有指导意义。

【关键词】  骨肉瘤；Skp2；p27；细胞周期

　　Expression of Skp2 and p27 in Osteosarcoma and Their Clinical Significance

　　Abstract：Objective  To investigate the expression of Skp2 and p27 and their association with clinical, histologic characteristics in osteosarcoma, the correlation between expression of Skp2 and p27 in osteosarcoma. Methods  Skp2 protein and p27 protein were examined by using immunohistochemical SP staining method in 48 cases of osteosarcoma and 16 cases of osteochondroma. Results  Negative expression of Skp2 was detected in all osteochondroma. In contrast, it was detected in 43.75%(21/48)of osteosarcoma. Positive expression of Skp2 was detected significantly more frequently in osteosarcoma than that of osteochondroma. Skp2 protein expression in osteosarcoma was positively associated with the clinical stage and differentiation. The positive rate of p27 protein in osteochondroma and osteosarcoma were 75%(12/16) 、47.92% (23/48), significant difference was found between these two groups. p27 protein expression in osteosarcoma was negatively associated with the clinical stage and differentiation. Skp2 was inversely associated with expression of p27 in osteosarcoma. Conclusion  Skp2 expression might play an important role in the development and progression of osteosarcoma via cyclin?depended kinase inhibitor p27 proteolysis, and the combined examination of Skp2 and p27 expression might be a guide for early diagnosis and a determinant of malignancy and prognosis of osteosarcoma.

　　Key words：Osteosarcoma；Skp2；p27；Cell cycle

　　0  引言

    Skp2是新近发现的一种癌基因，能对多种靶蛋白进行降解而与细胞周期调控密切相关。p27是公认的抑癌基因，控制细胞周期G1／S的转换。近年来研究表明，肿瘤中Skp2表达增高常伴随p27表达降低。而且在Skp2和p27同时异常表达时，患者预后更差。许多研究结果表明，Skp2基因在很多恶性肿瘤中都有过表达, 而Skp2在骨肉瘤中的表达情况国内外尚未见报道。本研究通过免疫组织化学SP法检测骨肉瘤中Skp2和p27蛋白的表达水平，以探讨它们在肿瘤中的表达特点以及两种蛋白异常表达与临床病理及患者预后的关系。

　　1  材料和方法

　　1.1  资料 

　　取自2000年1月～2005年6月华中科技大学同济医学院附属协和手术切除并经病理确诊为骨肉瘤的石蜡包埋标本48例。其中男27例，女21例，年龄7～30岁，平均14岁。其中有肺转移者16例，无肺转移者32例。根据临床资料，按Enneking外科分期分为：Ⅰ期8例；Ⅱa期12例；Ⅱb期22例；Ⅲ期6例。采用16例骨软骨瘤石蜡包埋组织作为对照组，来源同前。其中男14例，女6例，年龄10～35岁，平均19岁。两组病例术前均未接受放疗、化疗及非甾体类抗炎药。所取标本的病例经临床、X片、病理确诊。

　　1.2  主要试剂 

　　鼠抗人Skp2单克隆抗体，鼠抗人p27单克隆抗体，均为美国Zymed公司产品，工作浓度为1∶50。免疫组织化学染色试剂盒(SP盒)购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3  实验方法 

　　采用免疫组化SP法，具体操作按说明书进行。每例石蜡标本4μm厚连续切片，脱蜡至水，微波修复抗原，3％过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，正常羊血清处理15min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理15min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理15min，DAB显色， 自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗做阴性对照，用乳腺癌做阳性对照。

　　1.4  结果判断 

　　Skp2阳性染色呈棕黄色，主要定位于细胞核，偶可见细胞浆着色。p27蛋白阳性染色呈棕黄色，定位于细胞核。随机选择10个高倍视野，每个视野至少计数100个肿瘤细胞，阳性细胞百分率。Skp2阳性细胞数<5%为阴性(-)，5%～25%为阳性(+)，≥25%为强阳性(++)。p27阳性细胞数<10%为阴性(-)，10%～50%为阳性(+)， ≥50%为强阳性(++) 。

　　1.5  统计学处理 

　　采用chi?square方法进行χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析，所有数据均利用SPSS11.0统计学软件处理。

　　2  结果
　　2.1  Skp2在骨软骨瘤、骨肉瘤中的表达

    Skp2蛋白在16例骨软骨瘤中表达阴性（见图1）。在48例骨肉瘤中，21例Skp2表达阳性，Skp2的表达阳性率为43.75％（见图2），表达明显高于骨软骨瘤（P<0.01）。在骨肉瘤中，Skp2蛋白在不同年龄、性别及组织类型组中表达无显著性差异(P>0.05)，在不同病理分级、临床分期及远处转移组中，中低度分化组、Ⅱb～Ⅲ期组及有肺转移组分别明显高于高分化组(P<0.05)、Ⅰ～ Ⅱa期组(P<0.05)及无肺转移组(P<0.05)，见表1。

　　2.2  p27在骨软骨瘤、骨肉瘤中的表达

    p27蛋白在骨软骨瘤（见图3）、骨肉瘤（见图4）中的阳性表达率分别为81.25％、47.92%，骨肉瘤中p27蛋白的表达水平明显低于骨软骨瘤（P<0.05）。在骨肉瘤中，p27蛋白在不同年龄、性别及组织类型中的表达无显著性差异（P>0.05），而在不同病理分级、临床分期及远处转移组中，低分化组、Ⅱb～Ⅲ期组及有肺转移组分别明显低于高分化组(P<0.05)、I～Ⅱa期组(P<0.05)及无肺转移组(P<0.05)，见表1。表1  Skp2和p27在骨肉瘤中的表达及其与临床指标的关系（略）

　　2.3  Skp2和p27在骨肉瘤中表达的相互关系

    在骨肉瘤中Skp2阴性(-)组中，p27表达阳性率为66.67％（18/27）；Skp2阳性组(+～++)中，p27表达阳性率为23.81％（5/21）；对Skp2和p27的相关性分析发现，两者在骨肉瘤中表达呈明显负相关（χ2=8.694，r=-0.426），（P<0.01）。

　　3  讨论

    Skp2作为一种F?box蛋白在细胞周期的调控中发挥重要作用，在真核细胞中，通过泛素蛋白酶降解途径降解泛素化的蛋白质来严格调控细胞周期有序进行。其中SCF(Skp1?cullin?F?box蛋白)复合体起到了完成泛素化降解过程必须参与的泛素连接酶E3的作用。作为F?box蛋白成员之一的Skp2，在SCF复合体中对蛋白底物起着特异识别作用。Skp2的主要功能是作为SCF复合体的底物识别亚基，特异性识别磷酸化的底物并介导其泛素化降解。研究[1]发现Skp2是一种癌基因，与肿瘤的增殖、分化有关，在结、直肠癌，肺癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达。Signoretti等[2]研究发现,在人乳腺癌中, Skp2 的表达水平与肿瘤的恶性程度显著相关, 分化程度好的肿瘤Skp2低表达, 而恶性程度高的肿瘤Skp2高表达，且发现Skp2高表达的水平与肿瘤高分期、病理分型有关，恶性程度越高, 侵袭性越强, Skp2 表达水平越高。

　　Shigemasa等[3]发现Skp2在卵巢腺瘤和潜在恶性病变中几乎缺如，而在47.3%的卵巢腺癌中有表达。半定量PCR发现Skp2 mRNA在所有卵巢腺癌中大幅度增高。Log ? rank检验显示Skp2过度表达与患者预后不良有关。目前，尚未见Skp2在骨肉瘤组织中表达水平的报道。本研究结果显示，Skp2在骨肉瘤中的表达明显高于骨软骨瘤，提示Skp2参与骨组织的恶性转化过程。Skp2表达与临床分期、肿瘤分化程度及肺转移正相关，提示该基因表达上调可能与骨肉瘤的恶性程度、侵袭转移能力密切相关。

    目前已发现许多细胞周期调控因子，如E2F、cyclinD1、cyclinE、cyclinA、cyclinB、CDC25B、p21w、p27wkip1、p53都是通过Skp2泛素蛋白酶体途径的底物[4]。其中最受人们关注的p27是近年来新发现的G1期检查点相关基因，负性调节细胞增殖，被认为是一种候选的抑癌基因，p27异常表达与许多恶性肿瘤的预后密切相关。在有丝分裂因子的刺激下，p27羧基端的Thr?187先被CDK2磷酸化，该羧基端再与Skp2的LRR结构域结合而进入泛素化降解。在纤维母细胞中过量表达Skp2使细胞从G1期进入S期，在这些细胞中p27蛋白水平下降[5]。p27(T187A)突变的静止细胞中，p27不能被磷酸化和降解，因而抑制细胞进入S期[6]，表明Skp2通过调节p27的降解在G1～S期转变中发挥关键作用。Masuda等[7]在人胃癌中研究Skp2的临床和生物学意义表明Skp2的mRNA表达与p27蛋白呈负相关。Mantel? Cox法显示, Skp2 mRNA表达、淋巴结转移、淋巴浸润和组织浸润深度都是胃癌的预后因子, 表明Skp2 mRNA高表达虽与胃癌预后有关, 但可能不是其独立预后因子；稳定转染Skp2的胃癌细胞p27蛋白呈低表达, 癌细胞生长速率显著增高，抵抗放线菌素D的凋亡诱导, 侵袭力明显增高。本研究发现，在骨肉瘤中Skp2蛋白表达与p27蛋白表达呈明显负相关(r=-0.426，P<0.01)。提示Skp2蛋白在骨肉瘤中过表达促进了p27蛋白的降解，使p27水平降低，促进细胞由G1期进展至S期，从而促进骨肉瘤细胞的恶性进展和增殖。

    Skp2在恶性肿瘤中的表达及相关性，使之有可能成为肿瘤的靶分子。Stewart等[8]认为西卡前列腺素能够阻断Skp2 mRNA传递信号，从而降低Skp2的表达，最终阻止p27在G1后期的降解，故抑制F?box蛋白基因的表达，可有效抑制细胞分裂。通过转染的反义寡核苷酸减少Skp2的表达, 可抑制培养基上非小细胞肺癌癌细胞的侵袭与转移，说明Skp2有可能成为肺癌潜在的特异性治疗靶点[9]。本研究发现Skp2在骨肉瘤中表达增高，并与肿瘤的增殖、预后关系密切，在肿瘤的发生、中有重要作用，其能否作为骨肉瘤治疗的新靶点和愈后指标可进行更深入的研究。随着Skp2和其他细胞周期调控蛋白、癌基因、抑癌基因关系的深入研究及其调控机制的进一步阐明，将为骨肉瘤的诊治提供更充分的理论依据。以Skp2为靶点的抗癌治疗有望成为骨肉瘤治疗的一个新的突破口。

【】
  　　［1］Gstaiger M, Jordan R，Lim M, et al．Skp2 is oncogenic and overexpressed in human cancers［J］． Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98(9):5043? 5048.

　　［2］Signoretti S, Di Marcotullio L, Richardason A, et al. Oncogenic role of the ubiquitin ligase subunit Skp2 in human breast cancer［J］. J Clin Invest, 2002, 110(5):633?641.

　　［3］Shigemasa K, Gu L, O'Brein TJ, et al. Skp2 overexpression is a prognostic factor in patients with ovarian［J］. Cancer Res, 2003, 9(5):1756?1763.

　　［4］Ezoe S，Matsumura I，Nakata S，et al．GATA?2／estrogen receptor chimera regulates cytokine?dependent growth of hematopoietic cells through accumulation of p21(WAF1)and p27(Kip1)proteins［J］. Blood,2002,100(10):3512?3520.

　　［5］Carrano AC，Pagano M ．Role of the F?box protein Skp2 in adhesion?dependent cell cycle progression［J］．J Cell Biol，2001，153(7):1381?1390.

　　［6］Malek NP，Sundberg H，Mc Grew S，et al．A Mouse knock?in model exposes sequential proteolytic pathways that regulate p27Kipl in G1 and S phase［J］．Nature，2001，413(6853):323?327.

　　［7］Musuda TA, Inoue H, Sonoda H, et al. Clinical and biological significance of S?phase kinase associated protein 2 (Skp2) gene expression in gastric carcinoma: modulation of malignant phenotype by Skp2 overexpression, possibly via p27 proteolysis［J］. Cancer Res, 2002, 62(13):3819?3825.

　　［8］Stewart SA, Kothapalli D, Yung Y, et al. Antimitogenesis linked to regulation of Skp2 gene expression［J］. Biol Chem, 2004, 279(28):29109?29113.

　　［9］Yokoi S, Yasui K, Mori M, et al. Amplification and overexpression of Skp2 are associated with metastasis of non?small?cell lung cancer to lymph nodes［J］. Am J Pathol, 2004, 165(1):175?180.