不同佐剂增强小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤细胞免疫效应的比较

         作者：周伊，齐旭，马军，来宝长，司履生，王一理

【摘要】  目的 评价5种不同配方佐剂在低免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗保护性免疫中的细胞免疫增强作用。方法 实验组用5种不同配方的佐剂（FCA, FCA+IL?2+GM?CSF, FIA+IL?2+GM?CSF, FIA+SWZY, FIA+SWZY+IL?2+GM?CSF）和照射灭活的D5黑色素瘤细胞制成瘤苗免疫小鼠，对照组免疫用单纯灭活D5黑色素瘤细胞。末次免疫后3天各组取半数动物检测DTH反应、NK细胞活性及特异性CTL活性，剩余半数动物接种活D5黑色素瘤细胞，3周后再次检测上述各免疫学参数。结果与对照组相比，经免疫后的各实验组DTH反应、NK细胞活性、CTL活性均明显升高（P<0.05），但成瘤后随肿瘤增大，则呈下降趋势。结论 5种佐剂配方制成的瘤苗均能诱导免疫小鼠对低免疫原性肿瘤的细胞免疫应答。其中佐剂SWZY和FCA增强免疫的效果相当，而毒副作用较小，可望成为一种人类肿瘤免疫的新型佐剂。

【关键词】  佐剂；肿瘤疫苗；黑色素瘤

　　0  引言

    随着对肿瘤免疫机制不断的深入了解，肿瘤疫苗即肿瘤的特异性主动免疫治疗越来越引起人们的关注 [1]，而应用肿瘤细胞制成瘤苗的前提是肿瘤细胞表达具有免疫原性的肿瘤相关抗原，但人体自发性肿瘤多数免疫原性较弱，很难诱发宿主有效的抗肿瘤免疫效应，而最直接的且行之有效的方法就是应用有效的佐剂提高其免疫原性 [2，3]。本研究中，我们用FCA、FIA、IL?2、GM?CSF、SWZY等组成5种配方的佐剂和照射灭活的弱免疫原性D5黑色素瘤细胞制成瘤苗免疫小鼠，并对其免疫效果进行评价，试图筛选出一种毒副作用小、能增强弱免疫原性肿瘤抗原所诱发的保护性抗瘤效应的新型佐剂。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物和细胞株 

　　C57BL/6小鼠，雌性，8～10周龄，购自第四军医大学实验动物中心。小鼠低免疫原性黑色素瘤细胞株D5，由美国Oregon Health Science University 胡宏明博士馈赠；人胃低分化粘液腺癌细胞MGC80?3，由本室保存；小鼠白血病细胞YAC?1，由第四军医大学免疫学教研室馈赠。

　　1.1.2  主要试剂 

　　rhIL?2由四川肿瘤研究所提供；rmGM?CSF由美国胡宏明博士馈赠；弗氏不完全佐剂（FIA）、弗氏完全佐剂（FCA）由本室保存；佐剂SWZY由本室自制；MTT为Promega公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  瘤苗制备 

　　收获生长良好的D5细胞，经10 000 rad的60Co照射灭活，调整细胞浓度至2×107/ml备用。按下列配方制备5种佐剂瘤苗，即瘤苗A：FCA+灭活D5细胞，瘤苗B：FCA+rhIL?2+rmGM?CSF+灭活D5细胞，瘤苗C：FIA+rhIL?2+rmGM?CSF+灭活D5细胞，瘤苗D：FIA+SWZY佐剂+灭活D5细胞，瘤苗E：FIA+SWZY佐剂+rhIL?2+rmGM?CSF+灭活D5细胞，并制备不加佐剂的灭活D5细胞瘤苗作为对照。瘤苗中的IL?2按14×104U/kg、GM?CSF按14μg/kg加入，各组佐剂与灭活的D5细胞的体积比为1∶1，混合后分别制成油包水的乳剂疫苗及不含FIA或FCA的水剂疫苗(其余成分同上)，于4℃保存备用。

　　1.2.2  主动特异性免疫保护实验 

　　将小鼠随机分为6组，即注射瘤苗A、B、C、D、E的实验组和对照组，每组16只。各组小鼠接种不同瘤苗的量均为100μl（含1×106细胞数）。初次免疫后2、3、4周各强化免疫1次。其中前2次免疫用油包水的乳剂疫苗，后2次免疫用水剂疫苗。对照组免疫用单纯灭活D5细胞。末次免疫后3天，各实验组和对照组小鼠均处死一半，进行有关免疫学参数的测定，剩余小鼠皮下接种D5细胞3×105个（50μl），3周后处死存活的小鼠，再进行有关免疫学参数的检测。

　　1.2.3  DTH反应 

　　采用足垫肿胀试验检测特异性迟发型超敏反应（DTH）。每批小鼠在处死前1天，于每只小鼠的左后足垫注射1×105个（50μl）D5细胞冻融液，24h后用游标卡尺测量左、右足垫的厚度（10?1mm），以左足垫的厚度减去右足垫的厚度肿胀反应。

　　1.2.4  NK细胞活性检测 

　　用MTT法检测NK细胞活性，效应细胞为小鼠脾细胞，浓度1×106/ml。靶细胞为YAC?1细胞，浓度1×105/ml。效靶比例为10∶1，每个样本3个平行样。在酶联检测仪于570nm波长测A值。按下述公式计算NK活性，以杀伤率（%）表示。

    NK细胞活性（%）= [1?（实验孔（效+靶）A值 ? 效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%

　　1.2.5  特异性细胞毒性（CTL）测定 

　　用MTT法检测，效应细胞为小鼠脾细胞，靶细胞为D5细胞，其余方法、步骤同上。同时用MGC80?3细胞（人胃癌细胞株）作为对照。

　　1.3  统计学分析

    样本均数采用成组资料方差分析，配对资料采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  DTH反应

    末次免疫后3天，瘤苗A组小鼠的DTH反应最强，其余依次为瘤苗B、D、E、C组。各实验组小鼠的DTH反应均高于对照组小鼠(P<0.01)。接种肿瘤后3周，瘤苗A、B、D组小鼠的DTH反应较强，其次为瘤苗E、C组，各实验组均高于对照组(P<0.01），见表1。表1  小鼠足垫肿胀反应(10?1mm)(略)

　　2.2  NK细胞活性

    末次免疫后3天及接种肿瘤后3周，各实验组小鼠脾NK细胞的杀伤活性均高于对照组小鼠(P<0.01)，但各实验组之间的杀伤活性无统计学差异（P>0.1）。实验组及对照组接种肿瘤后3周与末次免疫后3天的NK细胞活性比较略有降低，但无统计学差异，见表2。表2  小鼠NK细胞活性（杀伤率%）(略)

　　2.3  特异性细胞毒（CTL）活性
   
　　末次免疫后3天，各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率均高于对MGC80?3细胞杀伤率(P<0.05)，而对照组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率与对MGC80?3细胞杀伤率比较差异无统计学意义（P>0.1）。并且各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率均高于对照组，其中A、B、D组较C、E组高(P<0.05)。接种肿瘤后3周，各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率亦高于对MGC80?3细胞杀伤率(P<0.05)，且各实验组对D5细胞杀伤率均高于对照组(P<0.05)，此时各实验组间对D5细胞杀伤率基本相当（P>0.05）。各组接种肿瘤后3周对D5细胞的杀伤率与末次免疫后3天比较，总体有下降趋势，但无统计学意义（P>0.05），而对MGC80?3细胞杀伤率，各实验组均有明显下降(P<0.05，表3)。表3  小鼠脾细胞对D5细胞和MGC80?3细胞的杀伤活性(%)(略)

　　3  讨论

    D5细胞是小鼠自发性黑色瘤细胞株B16BL6的一个变异株，不表达或仅表达极低水平的MHC?Ⅰ（H?2Db/Kb）类分子，不表达MHC?Ⅱ类分子 [4，5]。单独用射线灭活的D5细胞免疫小鼠不能保护宿主免受1×105同种瘤细胞的攻击，表明D5是一弱免疫原性肿瘤 [6]。

    NK细胞是重要的免疫效应细胞，其抗肿瘤作用已为众多证据所证实 [7]。DTH是评价细胞免疫最直接和常用的在体试验，免疫的效果可以通过产生迟发型超敏反应的强弱得到预测 [8]，特异性CTL也是目前公认的最为可靠的评价肿瘤主动免疫的指标 [9]。本实验中成瘤前后各含佐剂的实验组NK细胞活性均高于对照组，说明所用佐剂均可增强小鼠抗肿瘤的非特异性细胞免疫反应。并且各实验组特异性DTH反应、CTL活性也均高于对照组，其中瘤苗A（FCA）、B（FCA+IL?2+GM?CSF）、D（SWZY）组作用相对较强，提示所用佐剂也可不同程度增强小鼠抗肿瘤的特异性细胞免疫反应。总之，实验显示单独或联合使用FCA、IL?2、GM?CSF、SWZY佐剂制成的各种瘤苗免疫小鼠均可增强小鼠对弱免疫原性肿瘤的细胞免疫力。

    实验中小鼠在成瘤前后各组NK细胞活性和CTL活性尽管无统计学差别，但总体上均呈下降趋势，这一事实说明随肿瘤进展荷瘤小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能均有所降低，这和肿瘤患者的临床观察结果是一致的。

    SWZY是我室自行研制的一种新型免疫佐剂，本实验结果显示佐剂SWZY在诱导DTH反应，增强NK细胞活性、CTL杀伤活性方面均与FCA相当，但其局部的毒副作用小。对佐剂SWZY免疫调节作用的进一步研究将推动人用肿瘤疫苗佐剂的开发和应用。

【】
  　　［1］Schwaab T, Tretter CP, Gibson JJ, et al. Immunological effects of granulocyte?macrophage colony?stimulating factor and autologous tumor vaccine in patients with renal cell carcinoma [J]. J Urol，2004, 171(3):1036?1042.

　　 [2]秦燕.恶性肿瘤的瘤苗免疫治疗 [J].国外医学肿瘤学分册,2002,29(1):36?39.

　　 [3]Huang L,Ohno T.Protective antitumor immunity induced by fixed tumor cells in combination with adjuvant in a murine hepatoma model [J]. Cancer Lett, 2003, 202(2):153?159.

　　 [4] Hu HM, Urba WJ, Fox BA. Gene?modified tumor vaccine with therapeutic potential shifts tumor specific T cell response from a type 2 to a type 1 cytokine profile [J]. J Immunol, 1998, 161（6）:3033?3041.

　　 [5]王艳, 周乐, 耿宜萍,等. 低免疫原性肿瘤可诱导调节性T细胞增生 [J]. 中华病杂志, 2005, 34(9):583?587.

　　 [6]齐旭, 周伊, 王一理, 等. 同系细胞瘤苗对低免疫原性小鼠黑色素瘤治疗作用的研究 [J]. 肿瘤生物治疗杂志, 2002, 9(1):60?61.

　　 [7]Smyth MJ, Hayakawa Y, Takeda K, et al. New aspects of natural?killer?cell surveillance and therapy of cancer [J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(11):850?861.

　　 [8] Harris JE, Ryan L, Hoover HC Jr, et al. Adjuvant active specific immunotherapy for stage II and III colon cancer with an autologous tumor cell vaccine: Eastern Cooperative Oncology Group Study E5283 [J]. J Clin Oncol, 2000, 18(1):148?157.

　　 [9]刘英. 肿瘤抗原特异性细胞毒T细胞和肿瘤免疫治疗 [J]. 中国实验血液学杂志, 2004, 12(2):244?248.