rAd?p53的抑癌作用及体外转染后抑癌蛋白的表达
作者：王建华，纪宗正，闫立昆
【摘要】 目的 为了了解重组人p53腺病毒注射液（商品名“今又生”）对大肠癌?174细胞株的体外抑制作用及其半数致死量（IC50），更好地指导临床应用。方法 通过体外细胞培养、利用MTT法对比检测重组人p53腺病毒注射液与5?氟脲嘧啶、替加氟、顺铂、奥沙利铂、丝裂霉素以及紫杉醇等大肠癌常用化疗药物的IC50，明确重组人p53腺病毒注射液体外抑瘤活性的强弱；利用免疫组化检测技术检测重组人p53腺病毒体外转染大肠癌?174细胞株后，细胞凋亡、生长抑制与细胞内p53蛋白表达情况之间的关系。结果 重组人p53腺病毒注射液具有良好的体外抑瘤效应，IC50为5.73×1011VP，且有剂量和时间依赖性；但其单用时的体外抑癌远远逊于经典的化疗药物如丝裂霉素、5?氟脲嘧啶和顺铂等；五种不同滴度的重组人p53腺病毒注射液在体外大肠癌?174细胞株转染过程中皆出现了阳性染色结果，最早的阳性染色结果出现在p53基因转染24小时后，而空白对照组的免疫组化染色皆为阴性。结论 重组人p53腺病毒注射液具有明确的体外抑瘤效应，且有剂量和时间依赖性；但其单用时的体外?174细胞株的作用低于丝裂霉素、5?氧尿嘧啶和顺铂。
【关键词】 重组人p53腺病毒；细胞培养； MTT检测；基因转染；免疫组织化学
Abstract：Objective To understand the inhibition and IC50 (50% inhibiting concentration) of the recombinant adenoviral p53 gene (rAd?p53) for the colorectal cancer cells in vitro and to guide clinical practice. Methods We evaluate the efficiency (IC50) of the rAd?p53 and six kind of anti?cancer drugs (5?fluorouracil, tegafur, mitomycin c, cisplatin, oxaliplatin, paclitaxel) for human colorectal cancer cell line?174 through the cell culture and MTT chemosensitivity assay to make sure the anti?cancer capability of rAd?p53. Expression of p53 protein in transfection cells of colorectal cancer line?174 with rAd?p53 was evaluated by immunohistochemical stain. Results The rAd?p53 has good anti?cancer efficacy for the colorectal cancer cell line?174 in vitro, its IC50 is 5.73×1011 VP (viral particles) and it is dose?dependent and time?dependent. But its anti?cancer efficacy can′t be compared with the classical chemical medicine mitomycin c, 5?fluorouracil and cisplatin et al when it used alone. The immunohistochemistry stain in blank control group is negative. However five different density of rAd?p53 are all appeared positive result in infected colorectal cancer cells with rAd?p53 and earliest positive result presented at 24 hours after infection.Conclusion The rAd?p53 has good anti?cancer efficacy for the colorectal cancer cell line?174 in vitro, it is dose and time?dependent manner. But its anti?cancer efficacy worse than those of the classical chemical medicine mitomycin c, 5?fluorouracil and cisplatin etc. when it was used alone.
Key words：rAd?p53；Cell culture；MTT assay；Gene transfection；Immunohistochemistry stain
0 引言
目前肿瘤基因领域中研究最多的就是“人类基因组保护神”——抑癌基因p53。p53基因的改变，包括突变和（或）功能异常是肿瘤发生过程中最为常见的遗传变异［1,2］，尤其在结肠癌中更高达75%[3]。2004年我国率先将世界上第一种基因治疗药物——重组人p53腺病毒注射液（rAdp53 injection）应用于头颈部肿瘤患者的临床治疗。为了对比了解该注射液对大肠癌细胞株的体外生长抑制作用我们进行了如下试验。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验肿瘤细胞株
大肠癌174细胞株由西安大学医学院病理教研室王一理教授惠赠，最佳细胞接种浓度为（1.5～5.0）×104/ml，对数生长期为接种后的3～5天[4]。
1.1.2 重组人p53腺病毒注射液（rAd?p53）
深圳赛百诺基因技术有限公司产品，为同源重组人p53腺病毒。
1.2 方法
1.2.1 重组人p53腺病毒及临床常用化疗药物对大肠癌细胞体外生长抑制的对比测定（噻唑蓝比色法，即MTT法）。利用细胞存活率（细胞存活率=试验组光吸收值/对照组光吸收值×100%）对药物剂量对数作图并按作图法y=ax+b求出实验药物的IC50[5]。
1.2.2 消化、稀释、接种
0.25%的胰蛋白酶（GIBCO公司）消化大肠癌?174细胞株，并用含10%新生牛血清（北京鼎国）的RPMI 1640（GIBCO公司）培养液稀释成浓度为5×104个/ml均匀的单细胞悬液，将其以每孔200μl接种于96孔培养板（美国COSTAR），置于细胞孵育箱（美国NUAIRE），在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养。
1.2.3 基因转染
72h后实验组（共设3个浓度，每浓度设平行孔3个）每孔加入重组人p53腺病毒液100μl，浓度分别为1×1010VP、1×109VP、1×108VP；对照组每孔加入生理盐水100μl，连续测定96h。
1.2.4 显色
分别于转染后12、24、48、 72、 96h终止实验。在终止实验前4h，于每孔加入MTT 20μl（GIBCO公司），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入DMSO 150μl（西安化学制剂厂），水平振荡仪振荡10min，倒置显微镜下观察细胞内蓝紫色结晶完全溶解，形成均匀的蓝紫色溶液。
1.2.5 比色测定
选择450nm、630nm双波长，在酶联免疫检测仪（香港DENLEY DRAGON?352）上测定各孔光吸收值，记录结果，并药物的Imax%(Survival rate maximal inhibition)和IC50(50% Inhibition concentration)，用以比较不同化疗药物的体外抑瘤效应。同时测定其他6种常用化疗药物的Imax% 、IC50以便与rAd?p53对比，了解其抑癌活性的强弱。
1.2.6 免疫组化法检测rAd?p53体外转染大肠癌细胞后相关蛋白的表达情况
（1）消化、稀释、接种：同样将大肠癌?174细胞株，以每孔3×104个细胞的密度接种于预置有圆玻片（经多聚赖氨酸浸泡、高压灭菌预处理）的12孔细胞培养板中并置于细胞孵育箱中培养。（2）转染：72h后细胞生长良好，全部附于玻片上。分别以1×1011VP/孔、1×1010VP/孔、1×109VP/孔、1×108VP/孔、1×107VP/孔加入rAd?p53，在转染后1、2、6、12、24、48、72、96h捞出玻片，并以4℃无水乙醇固定10min，PBS冲洗3遍，晾干。实验过程中设置空白对照组，仅加入生理盐水100μl，不给予rAd?p53。（3）免疫组化检测：每张玻片滴加50μl 3%H2O2，室温下孵育10min。PBS冲洗3×3min。滴加一抗50μl (鼠抗人p53单克隆抗体，北京中杉金桥)，37℃孵育60min。PBS冲洗3×3min。滴加二抗50μl（即用型羊抗鼠IgG/HRP多聚体，北京中杉金桥），37℃孵育15min。PBS冲洗3×3min。滴加100μl DAB溶液，显微镜下观察显色。流水冲洗，苏木素复染。二甲苯透明后封片。
2 结果
按体外MTT检测结果，以细胞存活率为纵轴结合浓度的对数值绘制大肠癌174细胞株在rAd?p53作用下的细胞生长抑制曲线见图1。从曲线看不同浓度对大肠癌细胞生长抑制作用不同，随浓度变化抑制作用呈现正相关性剂量效应关系；同样，随药物作用时间的延长其对细胞的生长抑制也呈正相关时间效应关系。利用作图法y=ax+b计算rAdp53的IC50为5.73×1011VP/ml。
Imax%代表了化疗药物达到最大抑制时，残存肿瘤细胞的存活率。Imax%越大，表示残存的肿瘤细胞越多，药物的肿瘤抑制效应越小。不同药物之间的Imax%存在着明显的差异。表1列出了大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒及大肠癌常用的6种化疗药物Imax%的对比。表1 重组p53腺病毒与6种常用化疗药物对大肠癌174细胞株的Imax%对比（略）表2 大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒及常用化疗药物IC50的比较（略）
由此可以看出，10倍临床血浆峰浓度时丝裂霉素的抑瘤效应最强；1倍临床血浆峰浓度时5?氟尿嘧啶抑瘤效果最强；0.1倍临床血浆峰浓度时紫杉醇抑瘤效果最强。由此推论丝裂霉素、顺铂、奥沙利铂等随着浓度的增加体外抑瘤效果也在增强即表现出良好的剂量依赖效应；紫杉醇、5?氟尿嘧啶等则在0.1倍临床血浆峰浓度时表现良好的抑瘤效果即敏感性最好。
以药物达到最大抑瘤效应一半时所需的药物浓度IC50，来比较大肠癌?174细胞株对不同药物的敏感性。IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。表3列出了大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒及大肠癌常用的6种化疗药物的IC50（50% inhibiting concentration）数值。
从表2可以看出同等条件下，重组p53腺病毒抑制大肠癌?174细胞株的效应并不强，按IC50而言5?氟脲嘧啶、紫杉醇、丝裂霉素的作用最强，5?氟脲嘧啶仅需要临床血浆峰浓度的0.28倍即可以达到受试细胞的半数抑制；顺铂、奥沙利铂的抑制肿瘤细胞生长的作用较前者弱，但明显强于重组p53腺病毒、替加氟的作用。
基因转染后免疫组化染色结果如图2～7。5种不同滴度的重组人p53腺病毒注射液转染后皆出现了阳性染色结果且最早的阳性染色结果皆出现在基因转染24小时后，差别仅仅在于阳性染色的细胞数略有不同。阳性细胞表现为核棕染的细胞。空白对照组未进行基因转染，免疫组化染色为阴性。
3 讨论
大肠癌是一种常见的高发恶性肿瘤。在世界范围内其发病率位于各种恶性肿瘤的第2位；在我国大肠癌的发病率、死亡率逐年上升[6]。如何合理有效的大肠癌，尤其对于放、化疗不敏感且无法手术切除者已经成为令人关注的问题。
研究证实，p53基因的改变，在致癌过程中起着非常重要的作用[7?9]。野生型p53基因（wild type?p53 gene, wt?p53）是一个与细胞凋亡密切相关的抑癌基因[10]。早在1990年Baker、1993年Roth等［11，12］就先后观察到肿瘤细胞体外转染wt?p53后凋亡会明显增加。因此，以正常野生型p53基因进行替代治疗就成为大肠癌基因治疗的研究热点。
将基因导入细胞内的载体一般分为病毒类和非病毒类两种。rAd?p53注射液就是以目前应用最广泛的人V型腺病毒为载体同源重组人类p53基因构成的。腺病毒载体具有广泛的宿主感染性，提高了靶细胞的感染率；同时作为载体，其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全性较高[13]。目前多项实验已证实，无论靶细胞的p53基因缺失与否，都不会影响外源性野生型p53基因的细胞转导，并且癌细胞的生长抑制作用只取决于重组p53腺病毒的转染效率[14?17]。
通过体外MTT药敏检测，我们发现rAd?p53的IC50为5.73×1011VP/ml，并且具有剂量和时间依赖性。通过免疫组化染色检测我们观察到，外源性野生型p53基因转染24小时后，p53蛋白已经在大肠癌174细胞中合成并表达，与Ohtani等进行的裸鼠体内外源性p53基因转染的表达结果、表达时间相同[18]，且与转染的病毒滴度无关。此外通过免疫组化染色检测发现阳性染色片中，不同滴度转染后阳性细胞的数量略有差异，但免疫组化染色仅仅只是一种定性检查法，并非定量检查法，阳性细胞的计数并不代表基因转染的效率和细胞生长抑制的强度，仅仅证明抑癌基因p53可以成功转导入细胞，同时可以合成相应的功能蛋白，发挥其应有的监视作用，促进肿瘤细胞及受损细胞程序性凋亡。
rAd?p53的体外抑制肿瘤细胞生长的作用是确定的，但通过与大肠癌常用化疗药物的体外MTT药敏对比检测，却发现其单用时对大肠癌?174细胞株的抑制效果远远差于经典的化疗药物如丝裂霉素、5?氟尿嘧啶和顺铂等。所以，临床治疗过程中单独使用它进行大肠癌的非手术治疗可能无法获得令人满意的治疗效果。
rAd?p53不仅具有独立的抑制多种肿瘤生长的作用，还可以通过激活bax基因、抑制bcl?x基因以及诱导前凋亡基因PUMA、Bak及Fas的表达，促进细胞凋亡，提高多种肿瘤细胞对放化疗的敏感性[1]。对此有争议的是，p53还可能会通过诱导p21基因表达等机制，使肿瘤细胞只是生长停止而不发生凋亡，同时修复放化疗导致的DNA损伤，从而降低了肿瘤细胞对放化疗的敏感性［19］。究竟rAd?p53抑制肿瘤的作用以及与肿瘤放化疗之间的协同作用如何表现，尚待进一步深入研究证实。
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