AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制

             作者：姚林方，叶章群，陈志强，刘冠琳，孔德波，杨为民

【摘要】  目的 观察JAK2激酶抑制剂AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其抗癌机制。方法 应用不同剂量AG490处理膀胱癌细胞系BIU?87，台盼蓝排斥试验检测细胞活力，噻唑蓝比色试验检测细胞增殖，克隆形成试验进一步检测膀胱癌细胞系干细胞对药物的敏感性，Hoechst33258/PI荧光双染检测细胞凋亡特征，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，Western blot检测p?JAK2、STAT3、p?STAT3、Cyclin D1、bcl?xL蛋白表达水平；并建立膀胱癌荷瘤模型，观察AG490体内抗肿瘤作用。结果 AG490明显抑制膀胱癌细胞增殖和干细胞克隆形成，使细胞周期阻滞，促进膀胱癌细胞凋亡；并可使p?JAK2、STAT3、p?STAT3、Cyclin D1、bcl?xL蛋白表达水平明显下降。裸鼠移植瘤在AG490的作用下明显缩小。结论 AG490通过阻断STAT3信号通路，抑制膀胱癌细胞的增殖，促进其调亡。

【关键词】  膀胱癌；AG490；信号通路；抗癌效应

　　The Mechanism of Anticancer Effects of Janus Kinase Inhibitor AG490 in Human Bladder Cancer

　　　Abstract：Objective   To investigate the anticancer effects of Janus Kinase?selective inhibitor AG490 in human bladder cancer.Methods  The bladder cancer cell line BIU?87 was treated with AG490 in different doses. The cell vitality and proliferation were detected by Trypan Blue staining rejection, cell counting and MTT assay. Drug sensitivity of bladder cancer stem cells to AG490 was detected by clone formation counting assay. Fluorescence dyestuff Hoechst33258 and PI double?staining assay was used to investigate the cell apoptosis characteristics. Flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and apoptosis. The expressions of phosphorylation?specific JAK2(p?JAK2), STAT3, phosphorylation?specific STAT3(p?STAT3), Cyclin D1 and bcl?xL were measured by western blot.Results  AG490 could remarkably inhibit the proliferation of bladder cancer cells and the formation of the tumor stem cell clones, block the cell cycle, facilitate the apoptosis of bladder cancer cells, and result in less expression of p?JAK2, STAT3, p?STAT3, Cyclin D1 and bcl?xL.Conclusion  AG490 showed strong abilities of inhibiting the proliferation of bladder cancer cells and inducing their apoptosis through blocking the STAT3 signaling pathway.

　　Key words：Bladder cancer；AG490；Signaling pathway；Anticancer effects

　　0  引言

    膀胱癌是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系肿瘤首位，至今仍无特异的抗癌药物。信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路是当前细胞因子研究领域的热点，该通路异常活化与细胞异常增殖和恶性转化密切相关。而STAT3信号通路的异常活化源于JAK2（Janus kinase 2）激酶的异常激活[1]。研究发现JAK2激酶抑制剂AG490可特异性阻断STAT3信号通路，抑制肿瘤细胞生长，在白血病方面显示良好的抗肿瘤效应[2]。我们利用体外细胞培养技术和体内移植瘤模型，观察了AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响，了解AG490在膀胱癌中的抗癌效应，并进一步探讨其抗癌机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    膀胱癌细胞系BIU?87（编号：GDC120）购自武汉大学典型培养物保藏中心，用含10%胎牛血清（天津TBD公司）的完全RPMI?1640培养液（美国GIBCO公司），在37℃、5%CO2培养箱中培养。α?氰基?（3，4?羟基）N?苄苯乙烯胺(AG490)购自美国Calbiochem公司。胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、双苯并咪唑染料(Hoechst33258)和碘化丙啶(PI)均购自美国SIGMA公司。Annexin Ⅴ?FITC凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司。Western blot采用一抗（美国Santa Cruz公司）和碱性磷酸酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。BALB/c裸小鼠(nu/nu)购自中科院上海实验动物中心，均为雄性，4～6周龄，体重18～22g。

　　1.2  方法 

　　1.2.1  台盼蓝排斥试验 

　　细胞经不同浓度（25、50、100μmol/L）AG490处理24、48和72h后，制成单个细胞悬液（106/ml），取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液混匀，在3min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%

　　1.2.2  MTT法 

　　细胞接种于96孔板中，贴壁后无血清培养24h，使细胞同步化。按上述方法处理细胞，分别培养24、48和72h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，继续孵育4h，终止培养，吸尽孔内上清。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定570nm波长处光吸收值（A值）。细胞抑制率（%）=（1?实验组A值/对照组A值）×100%。

　　1.2.3  克隆形成试验 

　　制备单个细胞悬液，作梯度倍数稀释，按每皿300个细胞接种于培养皿中，细胞同步化和AG490处理同前，更换完全培养液继续培养2周后，用PBS（0.01mol/L，pH 7.4）浸洗2次，甲醇固定后，加适量姬姆萨染色，浸洗干燥，计数克隆数。50个细胞以上的集落算一个克隆，克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%

　　1.2.4  Hoechst33258/PI荧光双染 

　　在6孔板中铺板爬片，细胞同步化和AG490处理同前，加入Hoechst33258（5μg/ml）100μl，37℃避光反应10min。继续加入PI（50μg/ml）100μl，4℃避光反应20min。4%多聚甲醛固定细胞10min后，置于荧光显微镜下观察细胞形态结构及胞核的变化，每张玻片随机选择10个视野并计数，区分出坏死、凋亡和活细胞（细胞核或细胞质内见浓染致密的颗粒状亮蓝色荧光者为凋亡细胞，细胞核着均匀的淡蓝色荧光者为活细胞，呈弥散均匀的红色荧光者为坏死细胞），并出凋亡率、坏死率及存活率。

　　1.2.5  细胞周期检测

　　细胞接种于6孔板，细胞处理同上，收集细胞，PBS洗涤，70%冰乙醇固定，PI染色，应用FAC Sort 流式细胞仪（美国Becton?Dickson公司）进行检测，数据用美国BD公司Cell Quest细胞周期分析软件进行储存及分析。

　　1.2.6  细胞凋亡检测 

　　用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250μl结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin Ⅴ?FITC（终浓度1mg/L）和10μl PI溶液（终浓度2mg/L），混匀后于室温避光孵育15min，再加入400μl PBS，上流式细胞仪检测（美国Becton?Dickson公司）。

　　1.2.7  Western blot法

　　参照美国Santa Cruz公司提供的方法提取蛋白。以Bradford法作蛋白定量后，取50μg蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶（5%积层胶，10%分离胶）电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜，37℃封闭1h后，分别加入1∶1000稀释的一抗p?JAK2、STAT3、p?STAT3、Cyclin D1、bcl?xL后4℃过夜，加入碱性磷酸酶标记的二抗检测杂交蛋白。

　　1.2.8  体内移植瘤抑制试验 

　　制备细胞悬液接种于裸鼠背部，每个部位注射0.2ml(含5×106个活细胞)，当瘤块成形，直径达0.5～1.0cm时，即将动物随机分组，对照组腹腔注射生理盐水，实验组腹腔注射AG490。AG490每5mg用1ml DMSO+19ml ddH2O充分溶解，每次腹腔注射10mg/kg体重。以上两组均隔日注射1次，4天测肿瘤体积1次，用药21天颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量瘤重。计算瘤体积=长×宽2×0.5，单位cm3，抑瘤率(%)=(1?用药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%

　　1.3  统计学处理 

　　数据以±s表示，组间比较采用两样本均数的t检验，应用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析。   

　　2  结果

　　2.1  台盼蓝排斥试验和MTT实验结果见图1、2。随着AG490药物浓度增大和作用时间的延长，BIU?87细胞活力不断下降，AG490对细胞的抑制率不断增加，细胞增殖明显受到抑制，而相应空白对照组变化不明显，差异有统计学意义（P<0.01）。作用72h后，不同浓度(25、50、100μmol/L)的AG490对BIU?87细胞的抑制率分别为21.6%、48.4%、64.6%。

　　2.2  克隆形成试验进一步检测膀胱癌细胞系干细胞对药物的敏感性，见表1。可见随着AG490药物浓度的不断增大，BIU?87干细胞克隆数明显减少，克隆形成率从20.7%降至5.9%。不同浓度(25、50、100μmol/L)的AG490对BIU?87细胞克隆形成的抑制率分别为22.9%、56.1%、71.6%。表1  AG490对BIU?87干细胞克隆形成的影响（略）

    与空白对照组比较，*P<0.012.3  Hoechst33258/PI荧光双染可区分凋亡、坏死和存活细胞，随剂量增高凋亡细胞明显增加，100μmol/L 的AG490作用72h后，细胞凋亡率可达50%以上，见表2。表2  Hoechst33258/PI荧光双染检测细胞凋亡（略）

    与空白对照组比较，*P<0.012.4  流式细胞周期分析，随AG490作用时间延长G0～G1期细胞比率明显增多，而S期细胞比率明显减少，100μmol/L AG490作用72h后，G1期细胞比率由60.26%上升至81.03%，而S期细胞比率由25.18%下降至12.39%，表明细胞周期基本被阻滞于G1/S期，见表3。表3  AG490对膀胱癌细胞周期的影响（略）

　　2.5  流式细胞凋亡检测发现AG490明显促进BIU?87细胞的早期凋亡，见表4。100μmol/L AG490作用72h后，细胞早期凋亡率由2.13%增加至48.25%，具有显著性差异（P<0.01）。表4  流式细胞分析检测细胞早期凋亡（略）

    与空白对照组比较，* P<0.012.6  不同浓度(25、50、100μmol/L)AG490作用于BIU?87细胞72h后，JAK2活化蛋白p?JAK2和STAT3蛋白及其活化蛋白p?STAT3等STAT3信号通路各成员蛋白表达与活性明显下降，靶基因cyclin D1、bcl?xL蛋白表达水平亦明显下降，见图3。

　　2.7  膀胱癌细胞接种于裸鼠皮下1周后，可见背部成形的瘤块，移植成功率为100%。AG490组与阴性对照组比较，其肿瘤生长速度显著减慢，见图4。用药21天后处死所有裸鼠，测抑瘤率为74.49%。

　　3  讨论

    STAT3信号通路是调控细胞增殖、分化及凋亡的重要的细胞内信号通路。JAK2作为上游激酶活化后募集胞浆中的STAT3单体，使无活性的STAT3分子酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚体，转移入细胞核，结合DNA，导致特定靶基因的开启[3]。近年来研究发现，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，参与了人类恶性肿瘤的发生、和演进[4]。越来越多的肿瘤细胞系和人类癌组织表达异常活化的STAT3蛋白[5]。阻断该通路成为肿瘤的新靶点[6]。目前，已经发现AG490是该通路的特异性阻断剂。

    AG490即α?氰基?（3，4?羟基）N?苄苯乙烯胺，是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，分子式为C17H14N2O3，分子量为294.3，结构类似酪氨酸，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，是JAK2激酶抑制剂，可特异性阻断STAT3信号通路[7]。目前，AG490作为抗肿瘤药物已用于临床治疗白血病，特别是对JAK2异常活化导致的前B急性淋巴细胞白血病具有很好的治疗作用，同时毒副作用很小[2]。

    在本实验中，我们应用AG490作用于膀胱癌BIU?87细胞后，细胞增殖速度明显减慢，显著抑制了膀胱癌细胞系干细胞的克隆形成能力，细胞周期被阻滞于G1/S期，明显促进膀胱癌细胞凋亡，显著抑制裸鼠移植瘤生长，抑瘤率高达74.49%；并可使JAK2活化蛋白p?JAK2和STAT3蛋白及其活化蛋白p?STAT3表达与活性明显下降，有效阻断了STAT3信号通路的激活，最终使靶基因——细胞周期关键调控基因cyclin D1和凋亡抑制基因Bcl?xL的蛋白表达水平明显下降。由此可见，AG490通过阻断STAT3信号通路，抑制细胞周期关键调控基因cyclin D1的表达，明显抑制膀胱癌细胞的增殖，阻断凋亡抑制基因bcl?xL的表达，促进膀胱癌细胞的调亡，但其具体作用机制有待进一步研究。总之，AG490通过阻断STAT3信号通路发挥抗癌作用，有望成为膀胱癌治疗的新型药物。

【】
  　　［1］Hebenstreit D，Horejs?Hoeck J，Duschl A. JAK/STAT?dependent gene regulation by cytokines［J］. Drug News Perspect，2005，18(4)：243?249.

　　［2］Miyamoto N，Sugita K，Goi K，et al. The JAK2 inhibitor AG490 predominantly abrogates the growth of human B?precursor leukemic cells with 11q23 translocation or Philadelphia chromosome［J］. Leukemia，2001，15(11)：1758?1768.

　　［3］Levy DE，Darnell JE Jr. Stats：transcriptional control and biological impact［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(9)：651?662.

　　［4］Hodge DR，Hurt EM，Farrar WL. The role of IL?6 and STAT3 in inflammation and cancer［J］. Eur J Cancer，2005，41(16)：2502?2512.

　　［5］Yu H，Jove R. The STATs of cancer??new molecular targets come of age［J］. Nat Rev Cancer，2004，4(2)：97?105.

　　［6］Buettner R, Mora LB, Jove R. Activated STAT signaling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention［J］. Clin Cancer Res，2002，8(4)：945?954.

　　［7］Li WQ，Dehnade F，Zafarullah M. Oncostatin M?induced matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase?3 genes expression in chondrocytes requires Janus kinase/STAT signaling pathway［J］. J Immunol，2001，166(5)：3491?3498.