nm23?H1过表达对人白血病细胞系HL60细胞周期和分化的影响
作者：袁茵，鲁欣，张美英，黄树林，王一飞
【摘要】 目的 探讨nm23?H1基因过表达对人早幼粒白血病细胞株HL60细胞周期及分化的影响。方法 构建nm23?H1 cDNA的真核表达载体pEGFP?N1?nm23H1，脂质体介导瞬时转染HL60细胞；在荧光显微镜下观察nm23?H1?EGFP融合蛋白的表达情况；流式细胞术分析细胞周期变化；NBT还原比色法检测细胞的诱导分化能力。结果 转染48h nm23?H1?EGFP融合蛋白在HL60细胞内表达量最高，此时细胞周期处于S期的细胞明显增多，对分化诱导剂DMSO的敏感性下降。结论 nm23?H1基因的过表达能促进HL60细胞的增殖和抑制其分化。
【关键词】 nm23?H1基因；白血病；细胞周期；细胞分化
Abstract：Objective To investigate effects of nm23?H1 overexpression on cell cycle and differentiation of HL60 cells. Methods Recombinant expression vector pEGFP?N1?nm23H1 was constructed and transfected into HL60 cells with the aid of liposome in a transient way. Expression of fusion protein nm23?H1?EGFP was detected under the fluorescence microscope. Flow cytometry was adopted to analyze cell cycle. Differentiation rate of the DMSO?induced HL60 cells was tested by NBT reduction assay. Results Expression level of recombinant plasmid pEGFP?N1?nm23H1 in HL60 cells reached a peak at 48 h after transfection. Meanwhile, proportion of S?phase cells increased dramatically and HL60 cells became less sensitive to differentiation inducer DMSO. Conclusion Overexpression of nm23?H1 gene could stimulate proliferation but inhibit differentiation of HL60 cells. nm23?H1 gene might be a potential target of leukemia treatment.
Key words：nm23?H1 gene；Leukemia；Cell cycle；Cell differentiation
0 引言
白血病是一种常见的造血系统恶性肿瘤。目前，白血病在青少年恶性肿瘤中的发病率位居第一，在世界癌症总体发病率中位居第六，是严重危害人类健康的恶性疾病之一。研究发现，肿瘤转移抑制基因nm23?H1的表达水平与多种血液恶性肿瘤的恶化呈正相关，与病人的存活时间呈负相关，其高表达可作为白血病和淋巴瘤预后不良的指标之一[1]。本研究构建了可融合表达nm23?H1与报告基因绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达质粒，瞬时转染人早幼粒白血病细胞HL60，探讨了nm23?H1基因过表达对HL60细胞周期及分化的影响，旨在为以nm23?H1基因为分子靶点的白血病反义提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
人早幼粒白血病细胞株HL60，nm23?H1基因cDNA、真核表达质粒pEGFP?N1，E.coli Top10菌株由本室保存；限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ,T4 DNA连接酶，高保真DNA聚合酶PyrobestTM购自Takara公司；NBT粉剂为上海华舜公司产品；脂质体lipofectamineTM 2000购于Invitrogen；佛波酯（12?O?tetradecanoylphorbol? 13?acetate,TPA）为Sigma公司产品。
1.2 nm23?H1真核表达质粒的构建
PCR扩增nm23?H1基因cDNA，上游引物：5′?TTAGAATTCTGATGGCCAACTGTGAGCGT?3′，下游引物：5′?ATTCCGCGGTTCATAGATCCAGTTCTGA?3′；PCR条件为94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环。该扩增产物与pEGFP?N1质粒经EcoRI和SacⅡ双酶切、连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取若干重组子行菌落PCR、酶切和测序鉴定。大量抽提纯化正确质粒，BECKMAN DU 640型核酸蛋白分析仪测定浓度及纯度。
1.3 细胞转染
实验分转染pEGFP?N1?nm23H1组、转染pEG FP?N1空质粒组和未转染的对照组。将两种质粒DNA分别与lipofectamineTM 2000脂质体以1∶3(w/w)的比例混合，室温放置15min后加入对应板孔的细胞悬液中，质粒DNA的终浓度为6mg/L，对照组加入等体积的无血清培养液。37℃无血清培养24h后，每孔加入含20％小牛血清的RPMI?1640培养基100μl，使血清终体积分数为10％，继续培养24、48、72h。于每一时点在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白及其融合蛋白的表达程度。
1.4 流式细胞术检测细胞周期
收集各组细胞，冷PBS洗涤细胞2次(1 200r/min，5min)，取300μl含10%普通级小牛血清的PBS重悬细胞，震荡加入700μl无水乙醇，固定30min；冷PBS洗涤1次(1 500r/min，5min)，加入400μl PI染液，避光放置15min待测。
1.5 NBT还原比色实验
参照[2]，略有改进。HL60细胞以1×105/ml的密度接种于96孔板，作用于各实验组的质粒DNA和DMSO的终浓度分别为6mg/L和1.6%(v/v)。48h后进行NBT还原比色测定；同时设各组的平行孔，用MTT法测定活细胞数。以NBT和相应的MTT吸光度的比值表示HL60细胞NBT还原能力的大小。
1.6 统计学处理
实验数据以±s表示，样本均数间比较采用t检验。
2 结果
2.1 真核表达质粒pEGFP?N1?nm23H1的鉴定
双酶切和测序鉴定证明pEGFP?N1?nm23H1质粒重组构建成功。pEGFP?N1?nm23H1经EcoRⅠ和SacⅡ双酶切有2条电泳带约在4.7kb和459bp处，pEGFP?N1经EcoRⅠ单酶切有1条电泳带约在4.7kb处，见图1。
2.2 质粒转染的HL60细胞中报告基因EGFP蛋白的表达
用荧光显微镜实时观察绿色荧光蛋白及其融合蛋白在HL60细胞中表达情况。结果显示，EGFP蛋白及nm23?H1?EGFP融合蛋白在HL60细胞中均有表达，转染细胞在补加完全培养基后48h的发光率最高，即此时的蛋白表达最多，见图2。以下均为48h的实验结果。
2.3 转染pEGFP?N1?nm23H1对HL60细胞周期的影响
流式细胞术检测结果显示，与对照组和转空质粒组细胞相比，转染pEGFP?N1?nm23H1组细胞周期发生明显变化，S期细胞增多，见图3。
2.4 转染pEGFP?N1?nm23H1 48小时后对HL60细胞分化的影响
转染pEGFP?N1?nm23H1 48小时后的HL60细胞NBT还原能力下降（P<0.01），见表1。表1 48小时后HL60细胞NBT及MTT还原能力测定（略）注：#P<0.01 vs HL60+DMSO；▲P>0.05 vs HL60+DMSO
3 讨论
nm23?H1最初是作为一种肿瘤转移抑制基因而被发现的，它在乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌和恶性黑色素瘤等癌症患者癌组织中的表达水平与癌组织的转移潜能呈负相关[3]。nm23?H1具有广泛的生物学功能，除参与调控肿瘤转移之外，还与细胞的增殖、分化及个体发育有关。1995年Okabe?Kado从一株不分化的鼠髓性白血病细胞M1中分离到的一种分化抑制因子[4]被鉴定为nm23?H1，其高表达可抑制鼠、人白血病细胞的分化。nm23?H1在多种血液系统恶性肿瘤患者血清和血浆中的表达水平明显高于正常血细胞，而且较高的nm23?H1表达水平与较高的肿瘤侵润性或恶性程度、患者的预后不良、对初始化疗的不敏感性及总体存活率的降低呈密切的正相关性[5, 6]。
近年来随着分子生物学、基因组学研究的，部分白血病的发病机制已明确，相关基因的靶向有可能从根本上治愈白血病。本研究用PCR克隆的方法构建了真核表达质粒pEGFP?N1?nm23H1。根据pEGFP?N1多克隆位点部位的序列以及融合构建的要求，在上游引物的EcoRI酶切位点与nm23?H1起始密码子之间设计2个碱基TG，下游引物去掉终止密码子，以保证nm23?H1基因与其后的EGFP基因阅读框一致且基因内部无终止密码子。真核表达质粒pEGFP?N1带有CMV启动子，可驱动连接在其后MCS部位的外源基因在真核细胞中高效表达，同时具有G418或新霉素抗性，便于筛选稳定转染的抗性克隆。但HL60细胞最大的特点就是在分化诱导剂作用下的多向性分化，G418 作为筛选药物不但会降低HL60细胞存活率并产生毒性，还会诱导HL60细胞发生分化。为了排除这种干扰，我们采用脂质体瞬时转染法进行研究。转染组细胞在形态上与对照组细胞无显著差异，但增殖和分化状况大不相同。nm23?H1基因的过表达一方面促进HL60细胞的增殖,另一方面使HL60细胞对分化诱导剂DMSO的敏感性下降。说明nm23?H1基因很可能对白血病细胞的生长和分化起关键的调控作用，提示nm23?H1基因有可能成为治疗白血病和淋巴瘤的新靶点[7]。
【】
［1］Okabe?kado J, Kasukabe T, Honma Y. Expression of cell surface NM23 proteins of human leukemia cell lines of various cellular lineage and differentiation stages[J]. Leukemia Research, 2002, 26(6): 569?576.
[2] 夏丽娟，景永奎，韩锐. 一种快速的癌分化诱导剂筛选方法[J]. 中华血液学杂志, 1994, 15(2):99?101.
[3] De La Rosa A, Williams R L, Steeg P S. nm23/nucleoside diphosphate kinase: toward a structural and biochemical understanding of its biological functions[J]. BioEssays, 1995, 17(1): 53?62.
[4] Okabe?Kado J, Kasukabe T, Baba H, et al. Inhibitory action of nm23 proteins on induction of erythroid differentiation of human leukemia cells[J]. Biochemica Biophysica Acta, 1995, 1267(2): 101?106.
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