RASSF1A和p16转录本在非小细胞肺癌中的表达及启动子区甲基化
作者：刘桂芝,吴逸明, 杨继要
【摘要】 目的 研究RASSF1A和p16基因在国人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的转录及启动子区甲基化情况，探讨其转录失活的机制，为NSCLC的诊断和寻找新的途径。方法 应用半定量RT?PCR和甲基化特异性PCR法分析96例NSCLC及远癌正常肺组织中RASSF1A和p16基因mRNA的表达和启动子区甲基化情况。结果 (1) 53.12%(51/96)的NSCLC中RASSF1A表达明显下调或缺失；36.46%(35/96)的p16表达下调或缺失，而远癌正常肺组织均表达良好。(2) 96例NSCLC中RASSF1A甲基化率48.96%(47/96)，该基因表达明显下调或缺失的51例中39例 (76.5%)出现甲基化，表达正常的45例中8例(17.8%)出现甲基化，两组对比差异有统计学意义（P<0.05）；96例NSCLC中33例(34.38%)检测到p16启动子区甲基化，p16基因表达明显下调的35例中20例(57.1%)出现该基因CPG岛的甲基化，而表达正常的61例中13例(21.3%)出现甲基化，两组比较差异显著（P<0.05）。96例远癌正常肺组织均未检测到此两基因启动子有甲基化。结论 RASSF1A和p16基因mRNA在国人NSCLC中较高比例的表达下调或缺失；甲基化可能是两基因表达失活的主要原因。
【关键词】 RASSF1A；p16基因；逆转录聚合酶链反应；甲基化特异性PCR； 非小细胞肺癌
Abstract：Objective To explore the transcriptional expression and the promoter hypermethylation of Ras association domain family 1A gene(RASSF1A) and p16 gene, and the major mechanisms for silencing of these two genes in non?small cell lung cancer(NSCLC) in Chinese. Methods RT?PCR and Methylation?specific PCR (MSP) was used to detect the transcriptional expression and aberrant methylation of RASSF1A and p16 gene in 96 human NSCLC tissues and matched 96 normal lung tissues far from cancer area.Results (1) The transcriptional expression of RASSF1A and p16 gene was normal in all normal lung tissues far from cancer area but low or loss in 53.12%(51/96) carcinoma tissues for RASSF1A and in 36.46%(35/96) carcinoma tissues for p16 gene. (2) Of the 96 NSCLC samples, methylation was detected in 48.96% for RASSF1A, 34.38% for p16. RASSF1A methylation was observed 39 of 51 (76.5%) in NSCLC samples with obvious down?regulation expression of RASSF1A, 8 of 45 (17.8%) in cases in which the transcriptional expression of RASSF1A had no obvious change. The difference of two groups had statistical significance（P<0.05）. p16 gene promoter hypermethylation was found 20 of 35 (57.1%) in cases with low or loss expression of p16 gene mRNA, 13 of 61 (21.3%) in cases in which transcriptional expression of p16 gene was normal. The difference of two groups had statistical significance（P<0.05）. But no methylation was detected in 96 cancer?free tissues.Conclusion Loss or abnormal down?regulation of RASSF1A and p16 gene mRNA is a frequent event in patients with NSCLS in Chinese; The promoter hypermethylation of RASSF1A and p16 gene may be the major mechanisms for silencing of these two genes in NSCLC.
Key words：RASSF1A; p16 gene; RT?PCR; Methylation?specific PCR; Non?small cell lung cancer
0 引言
肺癌新型候选抑癌基因Ras相关结构域家族基因1A（Ras association domain family gene 1A， RASSF1A）是2000年报道从3号染色体短臂2区1带3亚带(3p2 1.3)克隆得到的[1]。p16基因又称为多肿瘤抑制基因(Multiple tumor suppressor 1, MTS1)，该基因位于9号染色体短臂2区1带（9P2 1）。两者在肺癌组织中存在着较高的表达缺失率[2,3]。国外的研究证明RASSF1A在肺癌中失活的主要机制是启动子区CPG岛的过度甲基化[4,5]，而国内此类研究较少。p16基因表达沉寂的机制过去一直认为是基因突变，然而，最近越来越多的研究证明，p16在肺癌组织中表达失活的主要原因是启动子区的高甲基化[6]。两基因尤其是RASSF1A在国人肺癌组织标本中的转录情况如何，其转录失活的机制是什么，两者均为肺癌抑癌基因，在肺癌发生及中有无关系，其相关报道甚少。为此我们观察并分析了96例非小细胞肺癌（Non?small cell lung cancer, NSCLC）患者癌组织及相应的远癌正常肺组织中RASSF1A和p16转录本的表达情况，并对转录表达正常、表达明显下调的NSCLC组织标本及相应的远癌正常肺组织标本进行了甲基化分析，旨在观察两基因尤其是RASSF1A在国人肺癌组织标本中的转录情况，探讨两基因转录失活的机制，以期为NSCLC的诊断提供新的分子标志物，为肺癌的治疗提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
本组标本均来自郑州大学第一临床医学院胸外科2005年3月～2006年5月间单一行外科手术治疗的96例NSCLC患者。其中男54 例，女42 例；年龄28～75岁，平均57±12岁。鳞癌42例，腺癌54例；按肺癌TNM国际分期标准：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期57例。每例取材包括癌组织及相应的远癌正常肺组织各1份，共192 份标本，癌组织和远癌正常肺组织标本均经组织病检查证实。
1.2 试剂盒和试剂
Trizol Reagent(Invitrogen公司产品)，AMV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工产品），2 × Taq PCR MasterMix（北京天为时代产品）。DNA提取试剂盒（V?gene公司产品），亚硫酸氢钠（Sigma公司产品），Wizard DNA cling up 试剂盒，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物TaKaRa公司，SssI甲基转移酶购自美国NEB公司。
1.3 引物
RASSF1A和p16基因引物设计[7，8]，由北京奥科生物技术有限公司合成，内参β?actin基因引物室友友情馈赠，见表1。
1.4 组织总RNA的提取
按Trizol 试剂说明书操作。应用U?2001型紫外分光光度计测定核酸A260和A280的值，检测总RNA的纯度和含量。取总RNA 8μl加1.5μl上样缓冲液在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测RNA的完整性。
1.5 半定量RT?PCR
cDNA第一链的合成：应用AMV第一链cDNA合成试剂盒，每份组织取5μg总RNA进行逆转录，反应体系为20μl。按照说明书加入各种试剂混匀后置37℃水浴1h，70℃ 10min终止反应，产物于-20℃保存。聚合酶链反应(PCR)：取癌组织和远癌正常肺组织的上述cDNA产物1.5μl为模板，以β?actin为内参照，分别扩增RASSF1 A和p16基因，目的基因和内参照同管扩增。PCR反应体系为25μl，2 × Taq PCR MasterMix 12.5μl，目的基因和内参照上下游引物各1μl，最后用去离子水补齐至25μl。循环参数：95℃ 3min，95℃ 40s， 58℃/RASSF1A、59.6℃/p16 1min，72℃ 40s，共36个循环，72℃终延伸5 min，至4℃完成反应。结果记录：取上述PCR反应产物5μl，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用ZF型紫外投射反射分析仪紫外灯下观察并进行凝胶扫描，用Gene Genius凝胶分析系统分析记录靶条带处光密度积分值。基因表达量：RASSF1A表达量=RASSF1A靶条带光密度积分值/β?actin靶条带光密度积分值；p16表达量=p16靶条带光密度积分值/β?actin靶条带光密度积分值。
表1 RASSF1A和p16 RT?PCR及MSP引物（略）
注：W：野生型引物；m：甲基化引物；U：未甲基化引物
1.6 提取组织DNA
按试剂盒说明书提取。
1.7 甲基化特异性PCR (Methylation?specific PCR，MSP)
(1)基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰：主要参照Hermen等[7]方法稍做改进。(2)甲基化和未甲基化阳性对照准备：Sss I甲基转移酶处理和未处理的胎盘组织DNA进行碱基修饰、PCR扩增分别作为甲基化阳性对照和未甲基化阳性对照，以等量去离子水作空白对照。(3) PCR: PCR反应体系为25μl：10 ×PCR Buffer 2.5μl (含1.5mmol/L MgCI2)， dNTP（1.25mmol/L）2μl，上下游引物各1μl， TaKaRa Taq HS (5U/μl )0.5μl；模板DNA：扩增野生型目的基因片段加1μl基因组DNA，扩增甲基化和未甲基化的目的基因片段加亚硫酸氢盐修饰后的DNA 3.5μl；最后用去离子水补齐至25μl。循环参数为：94℃ 5min，94℃ 30s， 58℃/RASSF1A W、58.5℃/p16 W 1min，72℃ 40s，共32个循环，最后72℃终延伸5min，4℃完成反应。94℃ 5min，94℃ 30s，57.2℃/RASSF1A M、55.5℃/RASSF1A U、63℃/p16 M、59.7℃/p16 U 1 min，72℃ 40s，共40个循环，72℃ 5min，至4℃结束反应。取上述PCR反应产物8μl，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析仪进行摄像分析。
1.8 统计学处理
应用SPSS12.0统计分析软件，采用χ2检验，Spearman相关分析，以α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 标本总RNA鉴定
测定总RNA OD260/OD280比值在1.79～1.98之间，说明无蛋白污染。经1%琼脂糖电泳鉴定见总RNA有清晰的28S和18S两条条带，表明RNA无降解，无DNA污染。
2.2 半定量RT?PCR结果
RASSF1 A和p16基因表达量≥0.83定为正常表达，≤0.50定为表达下调，凝胶图象中无凝胶分析软件可识别的条带为表达缺失。结果发现，53.12%(51/96)的NSCLC组织RASSF1A表达明显下调或缺失；36.46%(35/96)的NSCLC组织p16表达下调或缺失，而相应的远癌正常肺组织均表达良好，癌组织和正常肺组织两基因表达差异有统计学意义(P<0.05)，见图1～3、表1。
M: Marker; N: 远癌正常肺组织; T: 肺癌组织
图1 RASSF1A 转录本在肺癌组织和远癌正常肺组织中表达的凝胶电泳图像（略）
M: Marker; N: 远癌正常肺组织; T: 肺癌组织
图2 p16转录本在肺癌组织和远癌正常肺组织中表达的凝胶电泳图像（略）
M: Marker; R: RASSF1A; P: p16
图3 RASSF1A和p16在同一肺癌组织标本中表达的凝胶电泳图像（略）
2.3 RASSF1A和p16基因mRNA表达与NSCLC病人临床资料和肿瘤病理特征的关系
RASSF1A基因mRNA表达与患者的性别、年龄、是否吸烟及肿瘤的组织学类型和分化程度无关(P>0.05)；与肿瘤的TNM分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05)；p16转录本的表达与患者是否吸烟及肿瘤的分化程度无关(P>0.05)；但与患者的年龄、性别、肿瘤的组织学类型、TNM分期和有无淋巴结转移均有关(P<0.05)，见表2。
2.4 肺癌组织中RASSF1 A和p16基因mRNA表达的关系
96例NSCLC标本RASSF1A和p16基因mRNA水平表达的相关性分析结果显示，RASSF1A与p16表达呈正相关(rs=0.278，P<0.05)，见表3。
表1 RASSF1 A和p16基因在肺癌组织与相应远癌正常肺组织mRNA表达（略）
注：RASSF1A：χ2=69.45, P<0.005; p16: χ2=42.80,P<0.005
表2 RASSF1 A和p16基因mRNA表达与肺癌病人临床资料和肿瘤病理特征的关系（略）
表3 肺癌组织中RASSF1 A和p16基因在mRNA水平表达的关系（略）
注: rs=0.278, P<0.05
2.5 RASSF1A和p16基因启动子甲基化分析
应用MSP分析96例NSCLC组织及相应的远癌正常组织RASSF1A 和p16基因的启动子，电泳结果见图4、5。96例NSCLC组织有47例(48.96%)检测到RASSF1A启动子区甲基化，在该基因表达明显下调或缺失的51例中 39例(76.5%)出现甲基化，表达水平无明显变化的45例中8例(17.8%)出现甲基化，两组对比差异有统计学意义（P<0.05）；96例NSCLC组织标本33例(34.38%)检测到p16启动子区甲基化，p16基因表达明显下调的35例癌组织标本中20例(57.1%)出现CPG岛的甲基化，而表达正常的61例中13例(21.3%)出现甲基化，两组比较差异显著（P<0.05）。96例远癌正常肺组织均未检测到此两基因启动子有甲基化。
M: Marker； N: 远癌正常肺组织； T: 肺癌组织；m: 甲基化；u: 未甲基化； P1: 甲基化阳性对照；P2: 未甲基化阳性对照；B: 空白对照
图4 部分病例RASSF1A基因启动子区MSP结果（略）
M: Marker； N: 远癌正常肺组织； T: 肺癌组织；m: 甲基化；u：未甲基化；P1：甲基化阳性对照；P2：未甲基化阳性对照；B：空白对照
图5 部分病例p16基因启动子区MSP结果（略）
3 讨论
3.1 RASSFIA和p16基因mRNA在NSCLC组织中的表达
RASSF1A是新近发现的候选肺癌抑癌基因，该基因在肺癌等肿瘤中存在着较高的表达缺失率[2，9]。国内学者邵康等[9]观察研究了国人肺癌组织RASSF1A的表达情况，发现该基因的表达缺失率达53.2%，而相应的癌旁正常组织均有表达。
本研究结果显示，RASSF1A基因mRNA在NSCLC组织中53.12%表达明显下调，其中25%表达缺失，在远癌正常肺组织均表达良好。其缺失率低于邵康等[9]的报道（NSCLC组织: 缺失率43%～52%），可能的原因有，样本量的不同，PCR成分的差异，如Taq酶的效力等。
RASSF1A转录表达与患者的性别、年龄，肿瘤的组织学类型和分化程度均无关，表明该基因表达下调或缺失在NSCLC中是普遍的事件。RASSF1A基因mRNA表达与NSCLC的TNM分期和淋巴结转移显著相关，Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者的癌组织低表达或缺失率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，提示RASSF1A可能参与调控NSCLC的发生和过程，该基因表达下调或缺失可能预示着肺癌更易发生淋巴结转移，进而影响病人的预后[10]。吸烟组RASSF1A的表达下调或缺失率高于不吸烟组，但两组间尚无统计学差异(P>0.05)，可能与样本量不足或抽烟情况量化不够有关。
p16为多肿瘤抑制基因，p16蛋白与细胞周期素D1(cyclin D1)竞争与Cdk4结合，当p16与Cdk4结合后，能特异地抑制Cdk4的活性，使视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma,RB)不能磷酸化，RB与转录因子E2F紧密结合，阻止了与DNA合成有关的基因的表达，使细胞不能由G1期进入S期，从而抑制细胞增殖，阻止细胞生长[11]。该基因在NSCLC中存在着较高的表达缺失率[3]，在肺癌的发生和发展中起着十分重要的作用。
本研究结果显示，p16转录本在远癌正常肺组织都有较好表达，在NSCLC标本中36.46%表达明显下调或缺失，略低于报道的54%[12]。p16基因mRNA低表达或缺失率女性高于男性，且随年龄的增加而增加，提示p16与老年女性NSCLC的发生关系密切，p16可能用于老年女性NSCLC患者的基因诊断。但抽烟对其没有影响。
p16基因mRNA表达异常与NSCLC的组织学类型、TNM分期及有无淋巴结转移相关，其中腺癌mRNA表达下调或缺失率高于鳞癌(P<0.05)，临床Ⅲ、Ⅳ期患者高于临床Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P<0.05)，肿瘤的分化程度对其没有影响，与文献报道基本一致[12]。以上结果提示，p16基因表达改变可能与NSCLC的形成和发展有关，检测p16基因mRNA的表达，将有助于NSCLC早期诊断及评价预后。
3.2 RASSF1A和p16基因mRNA在NSCLC组织中表达的关系
RASSF1A和p16同为抑癌基因，在肺癌中均存在较高的表达缺失率，推测此两种基因的状态可能存在一定的内在联系。本实验相关性分析结果显示，RASSF1A和p16基因mRNA在NSCLC组织中的表达呈正相关(rs=0.278, P<0.05)，表明两者的表达有趋同性。p16是通过与cyclin D1竞争与Cdk4结合，使细胞阻止于G1～S期；Shivakumar等[13]研究发现，活化的RASSF1A蛋白能明显抑制cyclin D1在细胞内积聚，使RB去磷酸化，从而抑制细胞从G1期进入S期。cyclin D1是否为两基因联系的枢纽，尚待进一步研究。
3.3 RASSF1A和p16基因启动子甲基化分析
DNA甲基化导致的基因沉寂在人类肿瘤细胞中是一个极其普遍的现象，是某些抑癌基因功能丧失的重要原因。新型肺癌候选抑癌基因RASSF1A启动子区的高甲基化在肺癌组织中经常被检测到，国外学者研究发现，大约40%的NSCLC组织该基因发生甲基化[4,5]。最近，国内学者杨振华等[14]报道，国人NSCLC组织RASSF1A甲基化率达55%，本组实验结果RASSF1A甲基化率为48.96%，均略高于国外研究结果，是否国人NSCLC RASSF1A甲基化发生率更高，尚需加大样本量，规范实验方法进一步研究。本实验还发现，RASSF1A转录本表达明显下调或缺失的肺癌组织，其甲基化率达76.5%，表明甲基化是该基因沉寂的主要原因。
p16基因表达失活的原因可为突变、缺失，但该基因在肺癌组织中甲基化发生率为25%～80.2%[15]。本组病例p16甲基化率为34.38%，而p16 mRNA表达明显下调的NSCLC标本，其甲基化率为57.1%，表明该基因在NSCLC中主要是CPG岛甲基化失活。
以上结果表明，RASSF1A和p16基因甲基化在NSCLC中是比较普遍的事件，是两基因失活的主要原因。据文献报道，RASSF1A和p16基因的甲基化能在患者的体液中检测到[16]。因此，RASSF1A和p16有望成为NSCLC诊断的分子标志物。同时，CPG岛甲基化导致抑癌基因失活是一个可以逆转的表观遗传修饰过程，CPG岛去甲基化可直接恢复抑癌基因的功能[20]。去甲基化恢复抑癌基因RASSF1A和p16的功能，可能成为NSCLC基因治疗的新手段之一。
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