p38MAPK在结肠癌细胞凋亡中的作用及与COX?2的关系
作者：宋伟庆，刘玉，韦金英，周保军，韩彩丽，陈怡
【摘要】 目的 探讨结肠癌细胞p38MAPK介导celecoxib(COX?2选择性抑制剂) 抗肿瘤的作用及与COX?2的关系。方法 用MTT法检测celecoxib对人结肠癌HT?29细胞生长的作用，用Western blot法测定各组细胞COX?2和Phosph? p38MAPK蛋白表达量，采用流式细胞术检测celecoxib和SB203580(p38MAPK特异性抑制剂)作用后HT?29细胞凋亡和细胞周期分布。结果 p38MAPK和COX?2蛋白表达量与对照组（0.23±0.12）（0.95±0.14）相比，celecoxib可使p38MAPK蛋白表达水平明显升高（0.62±0.11），而使COX?2蛋白表达水平降低（0.44±0.11）；SB203580使p38MAPK（0.12±0.05）及COX?2蛋白（0.23±0.13）表达水平均降低；SB203580和celecoxib共同作用后, p38MAPK表达量介于celecoxib和 SB203580作用之间（0.43±0.12），COX?2表达量下降最为显著（0.15±0.10）。celecoxib和celecoxib+SB203580 均可显著诱导HT?29细胞凋亡（P<0.01和P<0.05），与对照组（4.31%）相比，其凋亡率分别为40.95%、26.24%。结论 在HT?29细胞中, celecoxib可通过活化p38MAPK而诱导结肠癌细胞凋亡,p38MAPK是COX?2的上游激酶，COX?2的表达水平受p38MAPK调控，并且COX?2可能对p38MAPK有负反馈调节作用。celecoxib是通过COX?2及其以外的p38MAPK通路诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用的。
【关键词】 结肠癌细胞株； COX?2； p38MAPK；信号转导；凋亡
Abstract：Objective To investigate the role of p38MAPK in mediating celecoxib (COX?2 selective inhibitor) inhibited the growth of tumor in colon cancer cells and its relationship COX?2.Methods The cell gowth activity of HT?29 cells after the treatment by celecoxib was observed by MTT assay, flow cytometry was used to observed the effect of celecoxib and SB203580(p38MAPK specific inhibitor ) on apoptosis and the cell cycle distribution of HT?29 cells, the expression of Phosph? p38MAPK and COX?2 protein was detected by Western blot.Results Compared with the expression of p38MAPK（0.23±0.12）and COX?2（0.95±0.14）of control group, p38MAPK expression（0.62±0.11）was higher than control group, while the expression of COX?2（0.44±0.11）was lower than control group which was treated by celecoxib. SB203580 could decrease the expression of p38MAPK（0.12±0.05）and COX?2（0.23±0.13）; the expression of p38MAPK（0.43±0.12）was lower than control group, which was between celecoxib and SB203580, the decrease of COX?2 was most significant（0.15±0.10）. Compared with the apoptosis of control group（4.31%）, celecoxib and celecoxib+SB203580 induced apoptosis significantly（P<0.01 and P<0.05）, the apoptosis rate of them was 40.95%、26.24% respectively.Conclusion Celecoxib can induced the apoptosis of human colon cancer HT?29 cell lines, which may through the activation of p38MAPK. In signal transduction of HT?29 cell lines, the upstream kinase of COX?2 is p38MAPK, the expression of COX?2 was regulation by p38MAPK, which has the effect of degenerative feedback regulation by COX?2. Celecoxib induced the apoptosis of tumor cells and play the role of anti?neoplasiasm through COX?2 and p38MAPK.
Key words：Colon cancer cell lines；COX?2；p38MAPK；Signal transduction；Apoptosis
0 引言
非甾体类抗炎药（Non?steroidal anti?inflammatory drugs, NSAIDs）是临床上常用的抗炎镇痛药，近年来发现它还具有抗癌作用,尤其是对结肠癌具有预防和作用。但对于NSAIDs抗肿瘤作用的详细机制目前尚未完全明确，有研究表明NSAIDs主要的抗癌机制是抑制COX?2途径，通过抑制COX阻断花生四烯酸转化为前列腺素的生物合成，从而发挥抗肿瘤的作用。但这并不是唯一的途径，又有研究发现使用NSAIDs可能通过启动细胞信号转导通路中p38MAPK通路来诱导肿瘤细胞凋亡。Bhoumik等[1]研究显示, p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen?activated protein kinase, p38MAPK）信号转导通路是细胞信号传导的交汇点，在凋亡途径中可被启动，通过诱导肿瘤细胞的凋亡达到抗肿瘤的作用，而同时p38MAPK又参与了COX?2的转录调控。故本研究采用MTT法、Western Blot法及流式细胞分析技术，探讨结肠癌HT?29细胞中p38MAPK在celecoxib抗肿瘤中的作用及其与COX?2关系的研究，为进一步阐明非甾体类抗炎药的抑瘤机制提供。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
结肠癌细胞株HT?29(购自协和医科大学细胞中心)在含有5%胎牛血清(美国HyClone公司)，105U/L青霉素，100mg/L链霉素的DMEM/F12培养基(美国HyClone公司) 37℃、5% CO2条件下体外常规培养。
1.2 试剂
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）。COX?2抗体、COX?2特异性抑制剂celecoxib、磷酸化p38MAPK抗体、p38MAPK特异性抑制剂SB203580（Santa Cruz公司）。免疫组化试剂盒SABC（北京中山生物技术有限公司）。DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.3 MTT法检测celecoxib对人结肠癌HT?29细胞增殖的抑制作用
HT?29细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液中常规培养。取对数生长期细胞，以1×104/孔接种于96孔板,培养4h细胞贴壁后， 轻轻吸去上清，加入celecoxib浓度梯度为20、40、60、80、100μmol/L。同时设不含药物的阴性对照组和溶剂对照组（分别加入等体积的培养基和最大浓度的DMSO，DMSO的体积分数为0.16%）。每浓度每时间点设6组，继续培养。分别于24、48、72h后各孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO 150μl，微量振荡器振摇10min，以使甲肷产物充分溶解，置酶标仪测570nm波长时各孔吸光度(Ａ值)。肿瘤细胞生长抑制率的：抑制率(%)=(对照组Ａ值?试验组Ａ值)/对照组Ａ值×100%。
1.4 分组及处理
实验分为对照组(Ctrl组)、celecoxib干预组(C组)、SB203580干预组(SB组)、先用SB203580干预30min后再用celecoxib处理组（SB+C组）。CON组：加入等体积的培养基；celecoxib组：70μmol/L的celecoxib（根据MTT实验结果）作用48h；SB组：5μmol/L的SB203580(根据参考[2]) 作用48h；SB+C组：先用5μmol/L的SB203580作用于HT?29细胞30min，然后再用70μmol/L的celecoxib作用48h。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡并分析其细胞周期
各实验组处理细胞48h后，收集细胞约1×106个，用2.5g/L胰蛋白酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定过夜，用碘化丙啶染色行细胞DNA(凋亡)含量的测定，并行细胞周期分析。采用美国Beckman Coulter公司Epics?XLⅡ型流式细胞仪，15mW氩离子激光器，激发波长为488nm。应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数（PI）表示细胞的增殖活性，公式：PI=（S期+G2M期）/（S期+G2M期+G0/G1期）×100%
1.6 Westernblot检测p38MAPK和COX?2表达
提取HT?29细胞总蛋白，考马斯亮蓝法粗定量，每次检测蛋白之前使用β?actin抗体对各样本的蛋白量进行剂量标准化检测。取等量总蛋白，8%SDS?PAGE电泳分离，将分离区带电转移至PVDF膜，加一抗（p38MAPK和COX?2工作液浓度分别为1∶50和1∶100）、二抗、三抗，DAB显色。结果扫描保存，Lab Works4.5凝胶成像软件（美国）行半定量分析，以积分光密度（IOD）表示。结果用相对积分光密度（IOD）来表示（β?actin作为内参对照，相对IOD值= COX?2、Phosph? p38MAPK的IOD值/ β?actin的IOD值 ），并与对照组的相对IOD值作比较。
1.7 统计学处理
应用SAS6.12软件对结果进行统计处理。数据结果均用±s表示，采用单样本Student’s?t检验和方差分析对相关数据进行检验，检验水准为0.05。
2 结果
2.1 celecoxib对HT?29细胞增殖的抑制作用
当celecoxib浓度达到20μmol/L时，就开始抑制HT?29细胞的增殖；随着其浓度增加，抑制率也增加；当其剂量为80μmol/L作用72h时，抑制率为50.07%。相关性分析表明celecoxib对HT?29细胞生长抑制作用呈时间和浓度依赖性（r=0.85～0.99、 P<0.01或P<0.05），见表1。
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡并分析其细胞周期
在二倍体细胞（G0/G1）峰前出现一个亚二倍体峰位判定为凋亡细胞蜂。对亚二倍体峰进行定量分析，可出细胞凋亡率。celecoxib作用于HT?29细胞后，与空白对照组相比，细胞增殖水平下降。celecoxib和SB203580共同作用于HT?29细胞后，G1期比率由66.20%上升到80.92%，而S期比率由30.07%下降到16.43%，细胞增殖受到抑制。celecoxib和SB203580共同作用于HT?29细胞后，凋亡细胞百分比分别由3.31%增加至65.24%，见表2。
表1 celecoxib对HT?29细胞增殖的影响（略）
Compared with control group,*P＜0.05、**P＜0.01。IR：Inhibitory rate
表2 HT?29细胞在不同实验组的增殖和凋亡情况（略）
Compared with control group，*P<0.05、**P<0.01
2.3 Western blot检测结果
2.3.1 P?p38MAPK蛋白的表达 p38MAPK蛋白分子量为38kD，SDS?PAGE电泳、Western杂交后在38kD位置出现了浅棕色的阳性条带。采用凝胶成像分析系统Lab Work4.5软件对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以积分光密度值（IOD）表示，以相对积分光密度P?p38MAPK/β?actin比较蛋白表达高低。与对照组相比，celecoxib组P?p38MAPK表达量增高；SB组P?p38MAPK的表达减少，SB+C组P?p38MAPK表达量介于celecoxib组和SB组之间,见图1、表2。
2.3.2 COX?2蛋白的表达 COX?2蛋白分子量为72kD，SDS?PAGE电泳、Western杂交后在72kD位置出现了浅棕色的阳性条带。采用凝胶成像分析系统Lab Work4.5软件对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以积分光密度值（IOD）表示，以相对积分光密度COX?2/β?actin比较蛋白表达高低。与对照组相比，celecoxib组COX?2表达量明显减少；SB组COX?2的表达也减少，SB+C组COX?2表达量最少，见图1、表3。
表3 Western blotting 检测HT?29细胞中P?p38MAPK 和 COX?2蛋白的表达（略）
Compared with control group,*P＜0.05、**P＜0.01
1：Control Group； 2：celecoxib Group；3： SB Group； 4：SB+C Group
图1 The protein expression of P?p38MAPK and COX?2 in the HT?29 cells by Western blotting（略）
3 讨论
流行病学证据表明非甾体类抗炎药(NSAIDs)可抑制结直肠肿瘤细胞增殖并逆转其癌前病变，此种作用的细胞靶被认为是诱导型COX?2，此酶在结直肠肿瘤中呈过表达，并导致前列腺素水平增高。然而，有研究显示，对COX?2的抑制潜能并不是NSAIDs抗肿瘤的唯一或最重要的机制,其抗肿瘤机制还远未清楚。NSAIDs可能通过细胞信号转导通路来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长、增殖，这为临床肿瘤又提供了一新的抗癌思路。NSAIDs可能通过作用于MAPKs信号转导通路来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的增殖和生长。近年来研究发现，MAPKs信号转导通路之一，即p38MAPK通路可导致蛋白合成、细胞表面受体表达、细胞骨架重构，最终导致细胞的凋亡[3]。p38MAPK通路中的p38MAPK表达和活性的变化，可以有效调节和阻断关键的信号通路，调控细胞凋亡。但该信号传导途径是否也介导了NSAIDs的抗肿瘤作用，迄今尚不清楚。
本研究首先应用MTT法测定了celecoxib对HT?29细胞增殖的抑制作用， 随celecoxib（20μmol/L）作用浓度增加抑制作用增强，两者存在着明显的量效关系。celecoxib剂量为70μmol/L作用48h，对HT?29细胞的抑制率为45.15%；流式细胞仪检测celecoxib作用于HT?29细胞细胞凋亡率为40.95%，celecoxib可通过诱导HT?29细胞凋亡而抑制其增殖。
本实验结果显示，p38MAPK特异性抑制剂使结肠癌细胞株COX?2和P?p38MAPK蛋白表达均下降；COX?2选择性抑制剂celecoxib可使COX?2蛋白表达明显下降，而P?p38MAPK被激活表达增高；两种药物联合作用COX?2蛋白表达最低，而P?p38MAPK蛋白表达介于两种药物组之间，提示p38MAPK可能是COX?2的上游激酶，当p38MAPK活化时可上调COX?2蛋白的表达，并且COX?2对p38MAPK有负反馈调节作用。Fan等[4]研究认为IL?1β诱导胃癌细胞COX?2表达是由p38和P42/44途径介导的，其分别单用IL?1β和先用IL?1β然后再用MEK和p38MAPK信号通路抑制剂PD98905、SB203580处理胃癌细胞株AGS时，结果显示在人胃癌细胞中, IL?1β可通过MEK和p38MAPK通路调控COX?2基因的表达以及PGE2的合成。还有研究表明激活MEKK1?SEK1/MKK4?p38MAPK途径可以诱导COX?2生成。本实验结果与李艳波等[5]研究一致。celecoxib可抑制COX?2蛋白表达，使COX?2对p38MAPK的反馈抑制作用减弱，通过上调p38MAPK的表达，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。
COX?2抑制剂作为强有力的抗肿瘤因子，其抗肿瘤机制存在COX?2非依赖性途径，而其效应与p38MAPK信号转导通路密切相关，可能是COX?2抑制剂抗结直肠癌的重要靶点。因此，人们提出信号转导干预治疗(interference therapy in signal transduction )这一新概念。即针对信号转导通路中发生异常环节来干预这种不正常的信号转导，以逆转肿瘤细胞恶性表型,从而达到抑制肿瘤生长的目的。本研究为选择COX?2抑制剂扩大其药物适应证及结肠癌的基因治疗提供依据。
【】
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