大肠癌组织中HSP70和p53蛋白的表达及其意义
作者：胡文秀, 杨成旺, 欧阳晓晖, 苏秀兰
【摘要】 目的 探讨大肠癌组织中HSP70和p53蛋白的表达特点及其相互间关系。方法 运用SP法结合图像分析，探讨HSP70和p53蛋白在大肠癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达。结果 在31例大肠癌、癌旁、正常组织标本中，HSP70表达的平均光密度值分别为:0.5917±0.0678、0.3363±0.0485、0.1742±0.0193; 癌组织中HSP70的表达水平显著升高，与癌旁、正常组织中的表达比较差异有统计学意义(P<0.01）。p53蛋白表达的平均光密度值分别为：0.7547±0.2732、0.5388±0.1542、0.3770±0.0682；癌组织中p53蛋白的表达水平显著升高，与癌旁、正常组织中的表达比较差异有统计学意义（P<0.01）。HSP70和p53在大肠癌组织中的表达存在依从关系（P <0.01），二者呈直线相关,相关系数r为0.795。结论 HSP70和p53蛋白在大肠癌组织中高表达，提示二者在大肠癌的发生中起一定的作用，是细胞恶变的指标之一；他们在大肠癌的发生发展中具有协同作用，或者在大肠癌组织中可能存在着HSP70?p53蛋白的复合物形式。
【关键词】 大肠癌; 热休克蛋白70; p53蛋白; 免疫组织化学
基金项目：内蒙古自治区人才开发基金资助项目
Expression and Significance of HSP70 and p53 Protein in Human Colorectal Carcinoma
Abstract：Objective To explore the expression feature and significance of heat shock protein 70 and p53 protein in human colorectal carcinoma、para?tumor tissue and normal tissue .Methods SP immunohistochemical technique and image analysis were used .Results ① In a total of 31 cases, the average value of light density of HSP70 were 0.5917±0.0678, 0.3363±0.0485, 0.1742±0.0193 and p53 proteins were 0.7547±0.2732,0.5388±0.1542,0.3770±0.0682 respectively; A high expression of HSP70 and p53 protein were discovered and showed a significant difference(P<0.01) in tumor tissue compared with para?tumor tissue and normal tissue ; ② The expression of HSP70 and p53 protein were a linear correlation and the correlation coefficient (r) of them was 0.795. There was a positive correlation between the expression of HSP70 and p53 protein in human colorectal carcinoma.Conclusion ① The results suggested that HSP70 and p53 protein might play an important role in the development of human colorectal carcinoma, and the result was able to a malignant index in cytology.②HSP70 and p53 protein might has a coordinated effect in the course of generation and development in human colorectal carcinoma,and might be associated with HSP70 and p53 protein compound form existence in human colorectal tumor tissue probably.
Key words：Human colorectal carcinoma; HSP70; p53 protein; Immunohistochemistry
0 引言
热休克蛋白（Heat shock proteins, HSP）是细胞受到各种刺激时产生的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族，在应激状态下可被诱导表达[1]。一些研究表明，HSP70与抑癌基因p53的关系密切[2]，但目前尚未见有关HSP70和p53蛋白在大肠癌中表达的相关报道。
本文运用SP法染色，图像分析HSP70和p53蛋白在大肠癌、癌旁及正常组织中的表达，以探讨大肠癌组织中HSP70和p53蛋白的表达特点及其相互关系。
1 资料与方法
1.1 资料
收集2003年10月～2004年9月内蒙古医学院附属大肠癌手术切除的病理标本,选择其中诊断明确资料完整的31例。男17例，女14例；结肠15例,直肠16例;年龄30～79岁;病理类型包括：高分化腺癌6例,高中分化腺癌2例,中分化腺癌11例,中?低分化腺癌1例,低分化腺癌1例，粘液腺癌9例，结肠恶性间质瘤1例;发生区域淋巴转移11例；Duke's分期:A期12例,B期7例,C期10例,D期2例;上述标本均于手术切除离体后30min内取样，每例均分别采集肿瘤组织、距癌肿边缘2cm处的癌旁组织、切除肠管一端切缘的正常组织，用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片厚4～5μm，常规HE染色及免疫组织化学法染色。
1.2 主要试剂法
兔抗人HSP70(突变型)单克隆抗体，鼠抗人p53单克隆抗体, UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 染色方法
石蜡切片常规脱蜡水化，枸橼酸缓冲液进行抗原热修复（微波炉中高中火98℃加热，HSP70组为10min，p53蛋白组为12min,室温冷却）。超敏免疫组织化学法（SP法）染色，操作按试剂盒说明书进行；HSP70单抗使用的最佳反应浓度为1∶250, p53单抗为即用型；用PBS代替一抗作阴性对照。用新鲜配制的DAB液显色，光镜下观察染色情况，HSP70组为5～10min，p53蛋白组为10min。 蒸馏水冲洗3min/次×3，苏木素复染：HSP70组为20min，p53蛋白组为8min；过自来水去掉多余的苏木素，过1%盐酸酒精分化，流动水冲洗10min返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.4 图像采集及分析
采用国产JD801图像分析系统（捷达形态图像分析系统,江苏捷达科技发展有限公司出品）,进行图像采集和光密度扫描，得出HSP70和p53蛋白表达的平均光密度值。
1.5 统计学处理
使用SPSS11.0统计分析软件进行统计学处理。多个样本均数间的多重比较，行方差分析F检验；HSP70和p53蛋白表达的相互间关系用直线回归与相关分析。
2 结果
2.1 HSP70的表达特征
光镜下HSP70阳性物质为棕黄色颗粒，定位于胞浆和胞核，以胞浆表达为主，见图1。31例大肠癌组织中，HSP70的表达水平显著升高，与癌旁、正常组织中的表达比较差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.2 p53蛋白在大肠癌组织中的表达特征
光镜下p53蛋白的阳性物质为深棕色颗粒，定位于胞核，见图2。 31例大肠癌组织中，p53蛋白的表达水平显著升高，与癌旁、正常组织中的表达比较差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
表1 HSP70和p53蛋白平均光密度值的表达（31例）（略）
**癌组织与癌旁、正常组织比较差异有统计学意义（P<0.01）；*癌旁组织与正常组织比较差异有统计学意义（P<0.01）
2.3 HSP70与p53蛋白在大肠癌组织中的表达及其相互关系
经统计学处理，结果显示，HSP70和p53蛋白在人大肠癌组织中的表达有依从关系（P<0.01），二者呈直线相关(linear correlation ),相关系数r为0.795,见图3。
图3 HSP70和p53蛋白在大肠癌组织中表达的平均光密度值散点图（略）
3 讨论
3.1 关于HSP70
自1970年HSP被正式发现和命名之后，对其的研究不断深入，并逐渐形成如下共识：HSP是细胞应激反应的生物标志; HSP是细胞的内源性保护蛋白;HSP具有分子伴侣作用;HSP可以作为肿瘤的标志物[5?7]; HSP是肿瘤免疫的分子佐剂等。
目前发现的HSP家族的成员有10余种，其中研究得较多最为关注的是HSP70,由于它在生物中的含量最多,并且在正常细胞中水平较低，而在应激后表达显著增高,是HSP中重要的成员，且具有高度保守性的一族。研究表明,肿瘤细胞具有较高水平的HSP70表达，肿瘤来源的HSP70具有强大的免疫原性和肿瘤特异性［8］, 因而在细胞的凋亡和诱导肿瘤免疫中起着重要的作用［9，10］。
本文检测了31例大肠癌组织中HSP70的表达，结果发现，HSP70在大肠癌、癌旁、正常组织中的表达呈递减的趋势，HSP70在大肠癌组织中高表达，与癌旁、正常组织中的表达比较差异有统计学意义（P<0.01），并且癌旁与正常组织中的表达比较差异也有统计学意义（P<0.01），证实了正常?癌旁?癌组织的“依行粘膜”的肿瘤发生、的存在，说明了随着肿瘤恶性程度的增加，细胞内HSP70的积聚也逐渐增多，提示HSP70可能是反映大肠癌生物学行为和预后的重要标记物，可以作为大肠癌的标志物。
3.2 关于p53蛋白
p53抑癌基因的突变和功能丧失是人类恶性肿瘤中最常见的基因变化[11]。
p53蛋白由393个氨基酸组成，可分为野生型p53蛋白（wt?p53蛋白）和突变型p53蛋白（mt?p53蛋白）。正常组织细胞中，p53的半衰期极短，表达水平极低，用SP法不能检测到；突变后的mt?p53半衰期延长,大量堆积于肿瘤细胞中,出现过量表达，可以用SP法在肿瘤组织中检测到[12]，所以一般认为SP法检测出的p53蛋白即为mt?p53蛋白。人类肿瘤一半以上有p53的突变和缺失，是目前所知人体肿瘤中最常见的基因改变[13]。
本组31例大肠癌中p53过度表达。p53蛋白在大肠癌组织中高表达，与癌旁、正常组织中的表达比较有统计学差异（P<0.01），并且随着肿瘤恶性程度的增加，p53蛋白在肿瘤细胞中的积累也逐渐增多，提示突变型p53在肿瘤细胞中积累也逐渐增多。提示mt?p53是细胞恶变的指标，p53在大肠癌的发生发展中起一定的作用。
3.3 关于HSP70和p53蛋白相互间的关系
HSP70和p53都被认为在肿瘤的发生和发展中起一定的作用。近年来研究发现，HSP70与原癌基因c?myc、抑癌基因p53关系密切[1]。肿瘤中常有p53和HSP的共同表达，HSP70水平的高低与p53基因的突变率正相关，所以p53与HSP70复合体的存在可能是某些肿瘤发生、发展的机制之一[14,15]。本文结果显示，HSP70和p53在人体大肠癌组织中的表达存在依从关系（P<0.01），两者呈直线相关。提示两者在肿瘤的发生、发展中具有协同作用，或者在人体大肠癌组织中可能存在着HSP70?p53蛋白的复合物形式。所以对p53基因及HSP70的研究，有助于设计基于p53的“基因”及研制特异性大肠癌瘤苗，因而具有广阔的应用前景。
【】
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