骨桥蛋白在人骨肉瘤中的表达及其临床意义

           作者：潘海涛，郑启新，郭晓东，刘勇

【摘要】  目的 研究骨肉瘤中骨桥蛋白(OPN) mRNA的表达及其与临床病理特征之间的关系，阐明骨桥蛋白在骨肉瘤侵袭转移中的作用。方法 应用半定量RT?PCR方法，检测OPN mRNA在58例骨肉瘤组织和25例瘤旁相对正常组织中的相对表达量，分析OPN mRNA的相对表达量与骨肉瘤临床病理特征的关系。结果 58例骨肉瘤组织标本中，OPN mRNA高表达率为81.0%(47/58)，而25例瘤旁相对正常组织标本中OPN mRNA高表达率仅16.0%(4/25)。OPN mRNA的表达与骨肉瘤的分化程度、侵袭范围、年龄以及GTM分期密切相关，而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤直径无关。58例患者随访12～24个月，平均18个月。术后复发23例，死亡8例。其中OPN mRNA高表达组47例中复发20例，死亡7例；而低表达组11例中复发3例，死亡1例。 结论 骨肉瘤中骨桥蛋白mRNA的表达明显增高。OPN mRNA的高表达反映了骨肉瘤病情的进展，并且与患者的预后有关，提示OPN可能是骨肉瘤的一种重要负性预后因子。骨桥蛋白在骨肉瘤远处转移过程中的作用有待进一步研究。

【关键词】  骨桥蛋白；骨肉瘤；预后

　　Abstract：Objective   To investigate the expression of osteopontin mRNA and its correlation with clinicopathologic features of osteosarcoma and elucidate its role in tumor invasion and distant metastasis.Methods  The expression of OPN mRNA was detected by semi?quantitive RT?PCR. The relationship between the relative content of OPN mRNA and clinicopathologic features of osteosarcoma was analyzed.Results  In 58 osteosarcoma tissue samples, the rate of OPN mRNA high?level expression was 81.0% (47/58). However, the high?level expression rate in all 25 cases of relative normal osteosarcoma was 16.0% (4/25). The expression of OPN mRNA was associated with the differentiation degree, scope of tumor invasion, years of age and GTM staging, but had no correlation with sex, tumor location and diameter. The 58 patients were followed up for 12～24 months (mean 18 months). The OPN mRNA high?level expression group (47 cases) had recurrence in 20 patients and death in 7 patients, whereas the low?level expression group (11 cases) had only 3 cases with recurrence and 1 case dead.Conclusion  OPN mRNA is overexpressed in osteosarcoma and it reflects the progression of diseases and association with poor prognosis of osteosarcoma. The role of OPN playing in the process of distant metastasis of osteosarcoma is required a further study.

　　Key words：Osteopontin mRNA；Osteosarcoma；Prognosis

　　0  引言
   
　　骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，其高致死率与肿瘤的高侵袭性和高转移性密切相关。骨桥蛋白 (Osteopontin,OPN)是一种具有多种生物活性的分泌型磷酸化糖蛋白，含有Arg?Gly?Asp (RGD) 序列，可与ανβ3整合素、CD44等受体相互作用[1,2]。近年来研究发现OPN参与恶性肿瘤细胞信号转导并促进恶性细胞的趋化、粘附、迁移和增殖，并在肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、大肠癌、脑胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞及其转移灶细胞中有明显升高的表达[1,3?5]。目前国内外尚未见人骨肉瘤中OPN表达的相关报道。我们应用半定量RT?PCR方法探讨人骨肉瘤中OPN的表达变化，并分析两者的表达与骨肉瘤临床及病理特性的关系，初步探讨OPN在骨肉瘤中表达的临床意义。

　　1  资料与方法
　　
　　1.1  临床资料
   
　　58例骨肉瘤标本取自同济医学院附属协和和同济医院手术患者，并均经病检证实；另取25例相对正常的瘤旁组织作为对照。年龄11～42岁，平均17.6岁；男38例，女20例。按GTM外科分期，Ⅰa  3例，Ⅰb  5例，Ⅱa  21例，Ⅱb  28例，Ⅲa  1例。术中切除原发病灶后,即刻切取新鲜骨肉瘤组织和瘤旁相对正常组织标本,生理盐水轻轻冲洗后,立即放入液氮中贮存备用。

　　1.2  方法

　　1.2.1  RNA提取及OPN cDNA的扩增
   
　　新鲜组织标本在液氮中研磨，Trizol匀浆后提取总RNA，取5μl RNA进行逆转录后取10μl  cDNA进行PCR扩增。引物由上海生工生物有限公司合成，OPN引物序列: P1: 5'?GCTCAGCACCTGAATGTACC?3'；P2:5'?CCTCGGCTCGATGGCTAGC?3'，扩增片段为292bp 。PCR 条件: 94℃  5min, 94℃  30s，55℃  45s，72℃  30s，35个循环，循环结束后72℃延伸7min。以β?actin作为内参照，引物P1: 5'?GTGGGGCGCCCCAGGCACCA?3'，P2: 5'?TTCCTTAATGTCACGCACGATTTC?3', 扩增片段为540bp。PCR 条件:94℃ 2min，94℃ 20s，58℃ 20s，72℃  20s，23 次循环，循环结束后72℃延伸5min。

　　1.2.2  半定量分析
   
　　取10μl PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，IS1000软件半定量分析。以OPN和β?actin电泳条带密度扫描值的比值作为OPN表达相对值，半定量分析OPN mRNA的表达水平，定义OPN mRNA 高表达为OPN/β?actin≥1.5[6]。

　　1.2.3  统计学分析
   
　　数据处理采用SPSS12.0统计软件,配对t检验，χ2 检验及方差分析。P<0.05为有统计学意义。
　　
　　2  结果

　　2.1  OPN mRNA在骨肉瘤组织中的表达
   
　　以OPN与β?actin电泳条带密度扫描值的比值OPN/β?actin作为OPN表达的相对值，半定量分析OPN mRNA 的表达水平，见图1。58例骨肉瘤肿瘤组织中，OPN mRNA相对表达值为2.12±0.44(3.16～0.88)。而25例瘤旁相对正常组织OPN mRNA的相对表达值为0.82±0.25(1.97～0.36)。统计学分析两者有非常显著性差异(t=3.450, P<0.01)。显然骨肉瘤组织OPN mRNA表达水平高于瘤旁正常组织。

　　1、2为骨肉瘤组织标本，3、4为瘤旁相对正常组织标本

　　图1  RT?PCR检测OPNmRNA的表达（略）

　　根据表达量，界定OPN/β?actin≥1.5为高表达，比值＜1.5为低表达。58例骨肉瘤组织中OPN  mRNA高表达率为81.0%(47/58)，低表达率为19.0%(11/58)；而25例瘤旁相对正常组织中OPN mRNA高表达率仅16.0%(4/25)，低表达率则为84.0%(21/25)。经统计学分析两者有显著性差异(P<0.01)，同样表明骨肉瘤组织OPN mRNA表达高于瘤旁正常组织。

　　2.2  OPN mRNA表达与骨肉瘤临床病理特征的关系
   
　　不同分期患者的骨肉瘤组织OPN mRNA表达存在显著性差异(F=5.22，P=0.022)，说明OPN mRNA的表达与骨肉瘤的分期密切相关。OPN mRNA的表达与肿瘤的分化程度、侵袭范围、年龄相关，而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤直径无关,见表1。

　　2.3  OPN mRNA的表达与患者复发率和生存率的关系
   
　　全部患者术后随访12～24个月，平均18个月。术后复发23例，死亡8例。其中OPN mRNA高表达组47例中复发20例，死亡7例；而低表达组11例中复发3例，死亡1例。两组的复发率和死亡率比较，P均＜0.05，结果表明OPN mRNA低表达组的术后生存率明显高于高表达组，而术后复发率则相反。

　　3  讨论
   
　　骨桥蛋白可广泛存在于骨、乳腺等人体正常组织中，并起重要的免疫作用，一般表达很低。近来人们研究发现，骨桥蛋白在肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、大肠癌、脑胶质瘤等多种恶性肿瘤及其转移灶中有明显升高的表达，提示OPN可能与肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关。Philip等[7]认为OPN转录活性的增强与细胞转移潜能的增加相关，肿瘤细胞或正常细胞产生的OPN均可刺激增强细胞的转移能力。当OPN的RGD序列被其受体整合素αvβ  3识别或与CD44 突变体结合后，能增加肿瘤细胞的粘附和癌细胞的迁移能力。OPN 诱导的信号通路活化以及与生长因子受体通路相互作用，激活了与肿瘤转移相关基因的表达,导致肿瘤的侵袭转移。

　　表1  骨桥蛋白mRNA的表达与骨肉瘤临床病理特征的关系（略）

　　*Fisher’s Exact Test   

　　本研究结果表明，OPN在骨肉瘤组织中也有较高的表达，显著高于瘤旁正常组织(P＜0.01)。从临床病理特征上分析，OPN mRNA表达与骨肉瘤的分化程度、侵袭范围、年龄相关，分化差的肿瘤OPN表达高于分化好的肿瘤，侵袭突破间室的肿瘤OPN表达高于间室内肿瘤，年龄越小的OPN表达也越高。骨肉瘤细胞通过高表达OPN，破坏细胞外基质，促进自身向周围趋化、粘附、迁移，恶性增殖以及促进新生血管的形成，致使肿瘤快速生长。OPN mRNA的表达反映了骨肉瘤恶性侵袭性的特征，对骨肉瘤的进展起着重要作用。从临床分期分析，OPN mRNA在不同GTM分期中存在显著的差异，Ⅱ～Ⅲ期OPN表达水平明显高于Ⅰ期，且Ⅱb高于Ⅱa，Ⅰb高于Ⅰa，OPN mRNA的表达反映了骨肉瘤恶性生物学行为的特征。研究同时表明，OPN mRNA的表达水平与患者的性别、肿瘤部位、肿瘤直径等病理特征无关。但对OPN mRNA的表达是否与肿瘤有无远处转移相关未作出判断，因为采集病例时发生远处转移的患者几乎都放弃手术而改用姑息(仅收集到1例手术标本)。骨桥蛋白促进肿瘤生长、进展和转移的机制比较复杂，可能与加强细胞粘附、促进血管内皮细胞移动、改变细胞内信号转导途径有关。但其确切的发生机制如是否OPN高表达通过突变型受体CD44v6高表达协同促进骨肉瘤发生、形成和进展等尚待进一步研究。
   
　　从患者预后上分析，OPN mRNA高表达患者的复发率则明显高于低表达病例，生存率明显低于低表达病例，提示OPN mRNA的表达与骨肉瘤患者的预后密切相关，可能是一个重要的负性预后因子，用于骨肉瘤的早期诊断和预后估计具有潜在价值，并可作为骨肉瘤基因治疗的新靶点。

【】
  　　[1] Rudland PS, Platt?Higgins A, El?Tanani M, et al. Prognostic significance of the metastasis?associated protein osteopontin in human breast cancer [J]. Cancer Res, 2002, 62(12):3417?3427.

　　[2] Liaw L, Skinner MP, Raines EW, et al. The adhesive and migratory effects of osteopontin are mediated via distinct cell surface integrins. Role of alpha v beta 3 in smooth muscle cell migration to osteopontin in vitro [J]. J Clin Invest, 1995,95(2):713?724.

　　[3] Pan HW, Ou YH, Peng SY, et al. Overexpression of osteopontin is associated with intrahepatic metastasis, early recurrence, and poorer prognosis of surgically resected hepato cellular carcinoma [J]. Cancer, 2003, 98(1):119?127.

　　[4] Coppola D, Szabo M, Boulware D, et al. Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies [J]. Clinical Cancer Res, 2004, 10(1):184?190.

　　[5] Schorge JO, Drake RD, Lee H, et al. Osteopontin as an adjunct to CA125 in detecting recurrent ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(10):3474?3478.

　　[6] 贺斌,刘银坤,汤钊猷，等. 肝癌中骨桥蛋白表达的临床意义 [J]. 中华肝脏病杂志, 1998, 6(3):208?210.

　　[7]Philip S, Bulbule A, Kundu GC. Osteopontin stimulates tumor growth and activation of promatrix metalloproteinase?2 through nuclear factor2 kappa B?mediated induction of membrane type 1 matrix metalloproteinasein murine melanoma cells[J]. J Biol Chem, 2001, 276(48):44926?44935.