鼻咽癌组织中DNA聚合酶β基因的突变

            作者：郑红，李明善，赵国强, 董子明

【摘要】  目的 研究鼻咽癌中是否存在DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ, polβ)的突变及变异情况。方法 采用RT?PCR法（逆转录?DNA聚合酶链反应）、PCR?SSCP（聚合酶链?单链构象多态性分析）、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织进行polβ基因突变研究。结果 鼻咽癌组织中存在polβ基因突变,且基因突变率与癌组织的病理分级有关, 高分化（G1）、中度分化（G2）、低分化及未分化（G3）鼻咽癌组织中polβ基因突变率分别为12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1与G2 比较,差异无统计学意义(P>0.01) , G1与G3 、G2与G3比较,差异均有统计学意义(P<0.005)。测序结果表明, polβ基因的第454位核苷酸由T变为C，其氨基酸变异为第114位氨基酸由Phe变为Ser；第466位核苷酸由G变为A，其氨基酸变异为第118位氨基酸由Gly变为Glu；第148位核苷酸由A变为G，其氨基酸变异为第28位氨基酸由Asn变为Ser。结论 发现在鼻咽癌组织中存在多种形式的polβ突变，导致氨基酸序列、空间结构的改变，可能与鼻咽癌的发生、相关。

【关键词】  DNA聚合酶β；鼻咽癌；基因突变

　　Abstract：Objective   To study DNA polymeraseβ(polβ) gene mutation in human nasopharyngeal cancer.Methods  40 cases of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues were collected to study DNA polβgene mutation with PT?PCR, PCR?SSCP and DNA sequence analyzing technique, the 40 cases of NPC were divided into three groups according to pathology differentiation,16 cases of grade Ⅰ(G1) ,14 cases of grade Ⅱ(G2) ,10 cases of grade Ⅲ(G3).Results  Polβgene mutation was detected by SSCP in 13 of 40 NPC tissues (with mutation rate 32.5%) and Many kinds of mutation were found by DNA sequencing, the mutation rate of G1, G2, G3 was 12.5%, 21.4%, 80% respectively. The sequencing of the PCR product showed an T to C chang at nucleotide 454 ,which resulted in a substitution of the amino acid from Phe to Ser at site 114; 466nt G→A resulting in Gly→Glu at 118 site ;148nt A→G resulting in Asn→Ser at 28 site.Conclusion  The study proves there is polβ alternation in human nasopharyngeal carcinoma, this induces change in amino acid and spatial structure. The mutation rate in low differentiated cancer was significantly higher than those in moderate and high ones. These mutations may be related with the development of NPC.

　　Key words：DNA polβ; Nasopharyngeal carcinoma; Gene mutation

　　0  引言
  
　　DNA聚合酶β（DNA polymerase β, polβ）是一种修复酶，在哺乳动物细胞中参与DNA的合成和修复的某些过程[1,2]。其缺陷与一些肿瘤的发生有关，在人类多种肿瘤中存在polβ突变[3?6]  ，然而有关鼻咽癌中有无polβ基因突变尚未见报道。我们采用逆转录?聚合酶链反应、单链构象多态性分析、DNA序列测定法对40例鼻咽癌组织进行了polβ基因突变研究。

　　1  资料和方法

　　1.1  研究对象  鼻咽癌标本40例，取自河南省郑州大学第一附属和河南大学附属淮河医院，病理证实均为鳞状上皮细胞癌，高分化（G1）16例，中度分化（G2）14例，低分化及未分化（G3）10例。病人均为北方人(河南29例、山东8例、山西3例），男31例，女9例，年龄28～76岁，平均57岁。

　　1.2  方法  GenBank的M13740序列设计出7对SSCP引物，1对完整的polβ全基因序列引物。按照RNA提取试剂盒步骤进行提取总RNA；逆转录合成cDNA，进行七区段扩增；取PCR扩增产物与变性载样缓冲液混匀，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。取下凝胶，银染后照相记录并分析SSCP结果；PCR产物与pGEM?T载体连接，转化入JM109细胞中进行PCR产物的克隆；用碱裂解法提取质粒DNA，利用荧光标记法ABI 377测序仪双向测定DNA序列（由上海生工公司完成）。所得结果利用DNASIS软件与GenBank中查到的DNA聚合酶β基因进行同源比较和分析。

　　1.3  统计学分析  采用χ2检验来比较不同分化程度鼻咽癌组织突变率的差异。
　　
　　2  结果

　　2.1  polβ  PCR?SSCP结果  40例鼻咽癌组织标本中有13例polβ基因SSCP异常，突变率为32.5%，见图1。

　　A、C、D、E： SSCP正常；B： SSCP异常

　　图1  polβ  PCR?SSCP结果（略）

　　2.2  测序结果比较峰值图  见图2。

　　图2  polβ基因454位T→C, 466位G→A变异峰值图（略）

　　2.3  polβ基因各变异位点对应的氨基酸变异情况  见表1。

　　表1  NPC1?3 polβ各变异位点对应的氨基酸变异情况（略）

　　NPC1?3为随机抽取的polβ PCR?SSCP异常的标本

　　2.4  鼻咽癌组织病理分级与polβ基因突变统计学结果  鼻咽癌组织中G1、G2 、G3 的POLB 基因突变率分别为12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1与G3 、G2与G3分别比较,差异均有统计学意义(χ2=11.82, P<0.005；χ2=8.07, P<0.005)；G1与G2 比较,差异无统计学意义(χ2=0.43, 0.50

　　3  讨论
   
　　DNA聚合酶β是一重要的DNA修复酶，该酶在哺乳类动物细胞的同源性以及在结构进化中的高度保守性说明它在生命活动中起着重要作用[7]。自从重组全DNA技术克隆出了polβ的cDNA以后，它的生物学功能越来越受到人们的关注，有人称其为生物进化过程的“看家酶”，其缺陷与一些肿瘤的发生有关。有报道在人类结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等都有polβ基因突变，尤以结直肠癌突变率最高，可达80%以上。然而有关鼻咽癌中有无DNA聚合酶β基因突变尚未见报道。由于PCR?SSCP技术的引入，使得从大量标本中准确、灵敏地筛选出polβ基因突变成为可能，对polβ基因突变的研究更为深入[8]。本课题通过对40例鼻咽癌（均为鳞癌）polβ基因的研究发现13例SSCP异常，突变率为32.5%，其突变点与报道的其他类型肿瘤中polβ的突变有所不同；核苷酸排列顺序的改变，导致氨基酸的改变，可能致使错配修复系统损伤，致原癌基因和肿瘤抑制基因突变, 最终导致肿瘤的发生；本研究还发现, polβ基因突变率随鼻咽癌的恶性程度而增加。尽管DNA聚合酶β基因与原癌基因与肿瘤抑制基因的关系还不十分清楚，但我们的研究表明鼻咽癌中存在polβ基因突变现象，可能与鼻咽癌的发生相关。

【】
  　　[1] Dobashi Y, Shuin T, Tsuruga H, et al. DNA polymerase β mutation in human prostate cancer[J] .Cancer Res, 1994，54(11):2827?2829.

　　[2] Giarnieri E, Mancini R, Pisani T, et al. Msh2, Mlh1, Fhit, p53, Bcl?2, and Bax expression in invasive and in situ squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(9):3600?3606.

　　[3] Ulrch Hubscher, Heinz?Peter, Nasheuer,et al. Syvaoja. Eukaryotic DNA polymerases, a growing family[J].TIBS,2000,25(3):143?147.

　　[4] Eydmann ME, Knowles MA.Mutation analysis of 8p genes POLB and PPP2CB in bladder cancer [J].Cancer Res, 1997，93(2):167?171.

　　[5] Iwanaga A, Ouchida M, Miyazaki K, et al. Functional mutation of DNA polymerase beta found in human gastric cancer?inability of the base excision repair in vitro [J]. Mutat Res, 1999,435(2):121?128.

　　[6] 董子明,赵国强,赵勤,等.人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究 [J].中华医学杂志,2002,82(13):899?902.

　　[7] Nowak R, Woszczynski M, Siedlecki JA. Changes in the DNA polymerase beta gene expression during development of lung, brain, and testis suggest an involvement of the enzyme in DNA recombination [J]. Exp Cell Res, 1990, 191(1):51?56.

　　[8] Canitrot Y, Cazaux C, Frechet M, et al. Overexpression of DNA polymerase beta in cell results in a mutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs[J]. Proc Natl Acad Sci ,1998,95(21):12586?12590.