微缺氧对三氧化二砷抑制胃癌细胞SGC?7901生长的影响
【摘要】 目的 常氧和微缺氧条件下三氧化二砷（As2O3）注射液对人胃癌细胞株SGC?7901生长抑制作用的对比研究。方法 运用产气袋法(GasPaK)制造微缺氧条件，实验分为微缺氧组和对照组，用MTT法检测药物效应。流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡。结果 不同浓度As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901生长有抑制作用，并呈剂量?效应关系。细胞滞留于G2/ M及S期。微缺氧条件下As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901生长抑制作用下降（P<0.01）。凋亡细胞百分比下降。结论 As2O3对人胃癌细胞生长有抑制作用，但对缺氧胃癌细胞的抑制作用下降，单用As2O3胃癌存在一定的局限性。
【关键词】 微缺氧；三氧化二砷；人胃癌细胞SGC?7901; 凋亡
Inhibitoy Effect of Arsenic Trioxide on Gastric Cancer Cell SGC?7901 During Hypoxia
Key words：Hypoxia; Arsenic trioxide; Gastric cancer cell line SGC?7901; Apopotosis
三氧化二砷（As2O3），经过多年的实验室研究和临床应用，在抗肿瘤治疗方面取得了肯定的疗效，其主要机制为诱导肿瘤细胞凋亡[1]。近年来许多研究证实其对多种消化系肿瘤细胞株的生长有抑制作用[2]，并发现其对实体肿瘤有一定的治疗效果[3]。但As2O3在微缺氧状态下对肿瘤细胞生长的抑制情况尚未见报道。本实验研究通过比较常氧和微缺氧条件下As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901生长抑制率的变化，对As2O3在微缺氧状态下对肿瘤细胞生长的抑制情况作初步的探讨。
1材料与方法
1.1材料
人胃癌细胞株SGC?7901（重庆医科大学病理生理教研室提供）。三氧化二砷（亚砷酸注射液，购于伊达药业有限公司），使用时配成（32、16、8、4、2）μmol/L；四甲基偶氮唑蓝(MTT)（购于上海华舜生物工程有限公司）。
1.2方法
1.2.1微缺氧条件的制造
运用产气袋法(GasPaK)制造微缺氧条件。通过血气分析仪监测含小牛血清的RPMI1640培养液中PO2、PCO2和pH的变化，本装置在48h内PO2、PCO2和pH稳定，并能达到微缺氧细胞培养的条件（1%～5%氧、5%二氧化碳及90%氮）[4]。
1.2.2MTT法检测As2O3对不同氧状态下SGC?7901细胞的抑制作用
将对数生长期的人胃癌细胞SGC?7901制成5×104个/mL的细胞悬液，每孔200μL加入两块96孔培养板内。实验设药物试验组及肿瘤细胞阴性对照组，将三氧化二砷的5个不同浓度分别加在96孔板内，每孔加药量20μL，每个剂量3个平行孔，重复7次。两块96孔培养板分为微缺氧组及常氧组。常氧组在CO2箱内培养(20%氧、5%二氧化碳及75%氮)48h，微缺氧组先入缺氧密封盒并放入37℃隔水式电热恒温烤箱孵育16h，取出后在CO2箱内继续培养32h。两者同时取出离心后吸弃上清，每孔加无血清1640 200μL，MTT20μL,CO2箱孵育4h弃上清。每孔加二甲亚砜（DMSO）200μL，用自动酶标读数仪（Bio?Rad?550型,美国,波长570nm）测定每孔A值。药物作用效应即抑制率(fa)=（1?实验组A值/对照组A值）×100%。根据中效方程式fa/fu=(D/Dm)m（fu为1?fa，D为药物浓度，m为斜率，Dm为中效浓度，即0.5效应时的药物浓度），Dm值。
1.2.3流式细胞仪分析
用As2O3常氧下中效浓度的1/3浓度(5.6μmol/L)为处理浓度，取对数生长期的人胃癌细胞SGC?7901制成5×104个/mL的细胞悬液，分为对照组、As2O3组、缺氧对照组、缺氧As2O3组各20mL细胞悬液入100mL培养瓶，As2O3组和缺氧As2O3组分别加入5.6μmol/L的As2O32mL处理SGC?7901细胞，缺氧对照组、缺氧As2O3组先入缺氧密封盒并放入恒温水浴箱孵育16h，取出在CO2箱内培养56h。对照组、As2O3组在CO2箱内培养。72h后0.1%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤，70%乙醇固定1h，PBS洗涤2次，将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4℃放置30min，将样品放入FCM的样品室，以激发波长488nm测定细胞周期，并用Modfit LT2.0软件分析。并重复5次。
1.3统计学处理
数据用±s表示，分析采用配对t检验或方差分析；数据均用统计软件包SAS8.0分析。
2结果
2.1常氧和微缺氧状态下As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901生长抑制作用的变化
不同浓度的As2O3在常氧状态下对SGC?7901生长均有抑制作用, 呈剂量?效应关系［γ=0.973，Dm=(19.32±0.52)μmol/L］。在微缺氧状态下，低浓度的As2O3（2μmol/L）对SGC?7901生长没有抑制作用，增高浓度后具有抑制作用, 并呈剂量?效应关系［γ=0.959，Dm=(34.56±0.31)μmol/L］。但同常氧状态下As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901的抑制率比较,微缺氧状态下, 各浓度的As2O3对人胃癌细胞株SGC?7901生长的抑制作用均有减弱, 抑制率明显下降（P<0.01），见表1。
2.2流式细胞仪检测结果
在不同氧状态下相同浓度的As2O3作用SGC?7901细胞72h后，SGC?7901细胞产生明显的亚 表1 不同氧状态下As2O3对人胃癌细胞株注:P<0.01两组间相同各浓度抑制率比较；★、▲P<0.01同各自细胞对照比较；◆P>0.05两组间细胞对照比较G1期峰，同未经处理的细胞对照组比较G2/ M及S期细胞百分比上升，Ｇ0/ G1细胞百分比下降，说明细胞滞留于G2/ M及S期。常氧下凋亡细胞占9.62%，而微缺氧组凋亡细胞占3.73%，即微缺氧组As2O3作用所诱导的凋亡率明显下降。未经As2O3处理的常氧及微缺氧细胞对照组间流式细胞仪分析结果无差异，见表2。 表2 不同氧状态下As2O3对SGC?7901细胞周期
3讨论
近年来，多项研究发现低浓度As2O3能通过诱导肿瘤细胞凋亡，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。有学者认为As2O3可能通过干扰巯基酶类的活性[5]，调控癌相关基因表达[6]以及通过阻抑癌细胞周期进程[7]等途径来抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞分化及凋亡。本实验资料显示，As2O3在不同氧状态下均能够抑制胃癌细胞SGC?7901增殖，呈剂量?效应关系；其在常氧下对人胃癌细胞SGC?7901生长的抑制率同报道相近[2]。本实验资料还显示，As2O3在不同氧状态下均能使Ｇ0/ G1 期SGC?7901细胞减少，细胞滞留于G2/ M及S期。凋亡细胞百分比分别为9.62%和3.73%。其中常氧下凋亡的百分比同报道相近[2]。表明As2O3对胃癌细胞的抑制作用主要是通过阻抑细胞周期进程和诱导凋亡而实现的。显示As2O3对胃癌有作用，在抗胃癌治疗中有应用的前景。
近年的研究表明，实质性肿瘤发生过程中，由于血管生长的相对滞后和肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤细胞缺氧[8]。肿瘤的缺氧是肿瘤发生恶性转化甚至转移的始动因素，以缺氧为显著特征的实质性肿瘤微环境是肿瘤细胞遗传不稳定的基本始动因素，缺氧介导肿瘤细胞的恶性筛选，对凋亡不敏感的以及表达突变型p53的肿瘤细胞在缺氧环境下具有明显的生存优势。缺氧作为一种生理性的选择，使得这些细胞筛选并存活下来，从而使肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡不敏感，导致缺氧肿瘤细胞对放、化疗耐受性的增加。缺氧还可以使肿瘤细胞内参与解毒和药物代谢的酶类表达增加，从而使进入细胞内的化疗药迅速被代谢而丧失效应[9,10]。本实验资料显示, As2O3对微缺氧处理的人胃癌细胞SGC?7901生长有抑制作用, 但同常氧下其对SGC?7901的抑制作用比较抑制率明显下降(P<0.01)。流式细胞仪结果显示常氧下As2O3作用于SGC?7901细胞，诱导细胞凋亡，凋亡细胞占9.62%。而微缺氧环境下同浓度等量的As2O3作用后凋亡细胞占3.73%。提示在微缺氧环境下As2O3的药物效应下降，诱导细胞凋亡的能力下降。其原因可能同缺氧微环境导致肿瘤细胞遗传不稳定，缺氧介导肿瘤细胞的恶性筛选以及缺氧时肿瘤细胞内参与解毒和药物代谢的酶类表达增加有关。
胃癌为实质性恶性肿瘤，存在有缺氧的肿瘤细胞。乏氧肿瘤细胞的存在导致其对放、化疗抗拒性增加，并可能导致As2O3在体内外对胃癌细胞抑制作用的变化。本实验资料显示As2O3能够明显抑制胃癌细胞SGC?7901增殖、诱导细胞凋亡，但在微缺氧环境下As2O3的效应下降，诱导细胞凋亡的能力下降。因此可以推测As2O3虽对胃癌实体肿瘤有一定治疗效果，但对胃癌中乏氧肿瘤细胞作用较弱，单用As2O3治疗胃癌实体肿瘤可能存在一定的局限性。如何增强As2O3对乏氧肿瘤细胞抑制作用，从而更好地发挥As2O3抗肿瘤作用，将是我们进一步研究的方向。
【文献】
［1］ Nolte F, Friedrich O, Rojewski M,et al.Depolarisation of the plasma membrane in the arsenic trioxide (As2O3)?and anti?CD95?induced apoptosis in myeloid cells[J]. FEBS Lett,2004,578(1?2):85?89.
[2]涂水平，江石湖，谭继宏,等.氧化砷抑制胃癌SGC?7901细胞增生和诱导凋亡作用[J].世界华人消化杂志，1999,7(1):18?21.
[3]刘秀峰，陈映霞，钱军,等.三氧化二砷注射液治疗中晚期原发性肝胆癌的临床研究[J].中华肿瘤杂志，2001,23(6):487?489.
[4]Gregg L.Expression of Hypoxia?inducible Factor 1:Mechanisms and Consequences[J].Biochem?pharmacol，2000,59(1):47?53.
[5]Hossain K,Akhand AA,Kato M,et al.Arsenite induces apoptosis of murine T lymphocytes through membrane raft_linked signaling for activation of C?Jun amino?terminal kinase[J]. J Immunol, 2000,165(8): 4290?4297.
[6]Jian XH，Chun YU, Wong B, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis in human gastric cancer cell through up_regulation of p53 and activation of caspase?3[J]. Int J Cancer, 2001,91(2): 173?179.
[7]Park WH, Seol JG, Kim ES, et al. Arsenic trioxide mediated growth inhibition in MC/CAR myeloma cells via cell cycle arrest in association with induction of cyclin?dependent kinase inhibitor p21 and apoptosis[J]. Cancer Res, 2000, 60(11): 3065?3071.
[8]Dachs GU, Tozer GM. Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation[J]. Eur J Cancer,2000,36(13 Spec No):1649?1660.
[9]Frederiksen LJ, Siemens DR, Heaton JP, et al. Hypoxia induced resistance to doxorubicin in prostate cancer cells is inhibited by low concentrations of glyceryl trinitrate[J]. J Urol,2003, 170(3):1003?1007.
[10]Shannon AM, Bouchier?Hayes DJ, Condron CM, et al.Tumour hypoxia, chemotherapeutic resistance and hypoxia?related therap[J]. Cancer Treat Rev,2003,29(4): 297?307.
