食管鳞状细胞癌染色体13q12?13 杂合性丢失

         作者：李光， 张海峰，王军梅， 徐妙生 ，王全红 

【摘要】  目的 分析食管鳞状细胞癌 (ESCC) 在13号染色体长臂12?13区（13q12?13）上的等位基因杂合性丢失（LOH），以期寻找13q12?13区上可能存在的与ESCC有关肿瘤抑制基因（TSG）的缺失区域。方法 用8个位于13q12?13区的微卫星标志物，对56例ESCC患者进行PCR?LOH分析，56例ESCC患者包括34例有上消化道癌家族史，22例无上消化道癌家族史。结果 56例ESCC患者中，48例（86%）显示一个或更多位点LOH；并发现一个LOH高频率区，位于位点D13S267和D13S219 之间，物理距离仅有2.83Mb；在位点D13S1242有上消化道癌家族史组LOH为68%，明显高于无上消化道癌家族史组的18%，(P=0.003); 在位点D13S289有上消化道癌家族史组LOH为82%，明显高于无上消化道癌家族史组的31%(P=0.008),有显著意义。结论 研究提示染色体13q12?13的LOH可能在食管癌发生中起重要作用，在染色体13q12?13区上，可能存在一个或多个与ESCC发生发展有关肿瘤抑制基因（TSG）。

【关键词】  食管鳞状细胞癌 ；杂合性丢失；肿瘤抑制基因

    Loss of Heterozygosity on Chromosome 13q12?13 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

    Key words：Esophageal squamous cell carcinoma;Loss of heterozygosity;Tumor suppression genes

    食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，70年代曾占中国人恶性肿瘤死亡的第2位[1]，现在仍居第4位[2]。而世界上70%的食管癌病例集中在中国，中国北方一些地区食管癌的发病率是世界最高的[3]。根据Knudson[4]抑癌基因失活形式的理论，检测肿瘤细胞染色体上特定DNA多态标记，分析杂合性丢失（Loss of heterozyosity, LOH）已成为目前检测肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG）失活和发现及定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一。本研究应用聚合酶连反应（PCR）方法分析56例食管鳞状细胞癌13号染色体长臂12?13区（13q12?13），8个位点微卫星多态标记物的LOH，以期寻找染色体13q12?13区上可能存在的与ESCC有关的肿瘤抑制基因TSG的缺丢区域。

    1  材料与方法

    1.1  标本

    56例ESCC标本取自山西省肿瘤1995年1月～1996年12月手术切除标本，其中食管上段1例，中段46例，下段9例。术前取10mL患者静脉血，患者年龄37～65岁，平均54.5岁。男性34例，女性22例。34例有上消化道癌家族史，22例无上消化道癌家族史。标本90%乙醇固定，石蜡包埋。

    1.2  激光显微切割和DNA提取

    患者静脉血DNA提取,用标准DNA抽提方法，2μL作为DNA模板用于PCR反应正常对照。肿瘤细胞显微切割在光镜下进行，具体方法如所述[5，6]。激光显微切割仪为（Laser capture microdissection LCM）Pixcell Ⅱ 100 ; Arcturus Engineering, Mountain view, CA） 切割下的细胞立即悬浮于50μL显微切割消化液中；消化液包含0.01M tri?HCl; 1mM MEDTA,1%Tween?20,  0.05mg/mL蛋白酶K，PH8.0，孵化37℃ 48h，混合液95℃ 10min，灭活蛋白酶K，2μL作为DNA模板用于PCR反应。

    1.3  LOH分析

    1.3.1  微卫星呈多态标记及PCR反应选择染色体物理定位于13q12?13上8个位点的微卫星标志：其中，D13S1242，D13S217，D13S289，D13S290，D13S260位于13q12.12;D13S267，D13A220，D13S219，位于13q12.3?13.1,进行LOH分析。微卫星引物购自美国Reserch Genetric公司。在10μL PCR反应体系中加入基因组DNA（肿瘤或静脉血）2μL（约含DNA100ng），1μL 10×PCR缓冲液，dNTP200 μmol/L，一对引物各2μmol/L，gold Ampli Taq DNA 聚合酶0.25u，1μci [α?32P]?dCTP, 加水至10μL后，加入10μL矿物油覆盖反应液，95℃变性10 min。循环条件为：95℃1 min，55℃～60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环后72℃延伸10 min。

    1.3.2  聚丙烯酰凝胶电泳PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍，95℃变性10 min加样4μL于6%变性聚丙烯酰胺凝胶，1 600V电泳1.5～2.5h，将凝胶转至滤纸上，真空干胶，与Kodak Bio Max MR胶片室温37℃ 24h后观察结果。

    1.3.3  LOH的判定杂和缺失的判定标准：相对于正常静脉血细胞DNA的一条带密度减少90%以上时可判为丢失。微卫星位点的纯合子病例（即该位点正常体细胞只显示一个基因条带）判为无信息病例。有信息的杂合子病例（该位点正常显示两个条带）分为两种情况，一种为放射自显影显示两个密度相似条带，未保留或未丢失，另一种则为一个条带丢失即等位基因杂合子缺失。

    1.4  统计学分析

    所有统计学分析采用SAS软件处理。精确t检验及χ2 ，检验P<0.05,统计学上有显著意义。

    2  结果

    2.1  临床资料56例ESCC，分级：Ⅰ级（分化好）6例；Ⅱ级（中等分化）44例；Ⅲ级（低分化及未分化）6例。淋巴结转移阳性20例，阴性36例。有上消化道家族史与无上消化道家族史病例在年龄、性别、部位、肿瘤分级、淋巴结转移等方面相比统计学上无显著意义，P>0.05。

    2.2  LOH: 对8个位点LOH分析，56例ESCC中，48例（86%）存在至少一个位点的LOH 。LOH频率为46%～83%。位点D13S267  LOH最高为83%。我们发现一个区域有非常高的LOH（LOH≥70%），定位于位点D13S267，D13S220和D13S219（LOH率分别为83%、71%和70%）。物理定位距离仅为2.83Mb。有上消化道癌家族史与无上消化道家族史LOH相比，在位点D13S1242有上消化道癌家族史组LOH为68%，明显高于无上消化道癌家族史组的18%(P=0.003); 在位点D13S289有上消化道癌家族史组LOH为82%，明显高于无上消化道癌家族史组的31%(P=0.008),有显著意义。肿瘤部位、分级及淋巴结转移与这些位点的LOH无显著相关性（P>0.05），见表1、图1。

    3  讨论

    食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，5年生存率低于10%。食管癌的发生有明显的地区差异性。作为世界上食管癌发生最高地区之一的山西省，研究表明，发生在这个区域的食管癌有很强的家族聚集性[7]。提示遗传易感因素可能对这特殊人群食管表1  食管鳞状细胞癌染色体13q12?13 杂合性丢失B为静脉血； t为鳞癌细胞；← 指示等位缺失带型1a显示在D13S267位点上，例057中t和例081中t均发生LOH,例066中B、t均未发生LOH；1b显示在D13S260位点上，例138中t发生LOH

    癌的发生起重要作用。肿瘤细胞染色体中某些杂合性位点的等位基因丢失称为杂合性缺失(LOH)。一般认为LOH是肿瘤抑制基因变异的重要分子特征，也是某些正常细胞的性质发生转化的重要标志。不同病理类型的肿瘤，在其发生过程中变异的肿瘤抑制基因类型也不尽相同。有的是在肿瘤早期启动阶段起作用，有的则是进展期恶性演进阶段才起作用，有的还与肿物转移与预后有关。LOH的检测是近年来检查肿瘤抑制基因改变的重要方法，高频率的LOH常提示目标区域可能存在与所研究肿瘤有关的肿瘤抑制基因。胡楠等对同一人群食管癌进行了前二项研究[8，9]：第一项用366个微卫星标志物对11例ESCC进行全部染色体的扫描；第二项在第一项结果的基础上，用18个微卫星标志物（在第一项研究中有非常高的LOH频率LOH≥75%）对46例有上消化道家族史的ESCC进行研究。其中第一项结果显示9个微卫星标志物位于13q，LOH频率为86%～100%；第二项结果显示3个微卫星标志物位于13q ，LOH为68%～77%，都表明ESCC在13q有非常高的LOH。本研究采用8个物理定位于染色体13q12?13更小区域的微卫星标志物，对56例ESCC进行更进一步LOH分析，48例（86%）存在至少一个位点的LOH，LOH频率为46%～83%，最高为83%，结果与我们前二项的结果相似。研究发现LOH频率非常高（LOH≥70%）的区域在位点D13S267与D13S2219之间，其三个位点D13S267，D13S220和D13S219的LOH频率分别为83%、71%和70%。D13S267与D13S219之间物理距离仅为2.83Mb。有上消化道癌家族史组与无上消化道癌家族史组相比，在位点D13S1242有上消化道癌家族史组LOH为68%，明显高于无上消化道癌家族史组18%(P=0.003); 在位点D13S289有上消化道癌家族史组LOH为82%，明显高于无上消化道癌家族史组31%(P=0.008),有显著意义;提示有上消化道癌家族史患者比无上消化道癌家族史患者更具有遗传不稳定性。与Harada等[10]对60例日本人ESCC（18个位于13q11?13微卫星标志物）研究相比，本组D13S289 LOH 60%，    日本组35%；本组D13S260 LOH 57%，日本组44%；本组D13S267 LOH  83%，日本组44%；本组D13S220 LOH 71%，日本组44%;本组频率明显高于日本组。这可能与下面几种原因有关：①本组采用先进的激光显微切割技术，使我们最大限度上获取纯的肿瘤细胞；②我们选用的人群来自食管癌的高发区，在遗传上更具有不稳定性；③染色体13q12?13的LOH对这组人群食管癌的发生确实起重要作用。另一项研究表明[11]，微卫星标记物D13S894位于13q12.3，检测食管上皮轻度非典型增生，重度非典型增生及浸润癌的LOH，分别为22%、50%和60%，可以看到遗传不稳定性在食管癌发展过程的积累；提示13q12?13的LOH可能是ESCC发生发展过程中的早期事件。 用366个微卫星标记物对食管鳞状细胞癌全染色体扫描显示，食管癌在多个位点有很高的LOH频率，证实食管癌的遗传不稳定性，与其他肿瘤相比这种不稳定更明显，提示维持遗传完整性基因功能的丧失是食管癌发生发展的基础[12，13]。我们的研究显示ESCC不仅在整个染色体有多个位点的LOH，而且在很小的染色体区域表现为间断性，散在的保留和丢失方式，同样丢失保留方式并未见我们用同样方法研究其他肿瘤（乳腺癌、前列腺癌）。研究表明[14?16]，乳腺癌、肝癌、前列腺癌、头颈肿瘤等在染色体13q11?13也存在较高的LOH，在这个区域唯一发现的肿瘤抑制基因（TSG）为乳腺癌易感基因（B2CA2）。但Harada及Montesano等[17]人对ESCC的BRCA2突变研究结果未发现任何突变，表明BRCA2可能对ESCC的发生发展没有明显作用，提示在这个区域可能存在一个或多个与ESCC发生发展有关的肿瘤抑制基因（TSG）。

    综上所述，染色体13q12?13的LOH在食管鳞状细胞癌发生发展中起重要作用，而且发生于食管癌发生的早期阶段——食管鳞状上皮轻度非典型增生。在这个区域可能存在一个或多个未知的与食管鳞状细胞癌发生发展有关的TSG，有上消化道癌家族史的食管癌患者更具有遗传不稳定性。

【】
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