环氧化酶?2抑制剂联合依托泊苷对肺癌细胞增殖凋亡的影响

              作者：邢丽华,刘剑波　张惠兰 ，张珍祥

【摘要】  目的 探讨环氧化酶?2(COX?2)抑制剂尼米舒利(NIM)与化疗药依托泊苷(VP?16)联用对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 培养人肺癌细胞A549：①NIM（25μmol/L）与VP?16（2～32μg/mL）联合，MTT试验观察干预48h后细胞增殖变化及增殖抑制率；②分为对照组、NIM 组（25μmol/L）、VP?16组（8μg/mL）和NIM +VP?16组，观察12h、24h及48h后A549细胞生长情况，描记生长曲线；流式细胞术检测干预48h后细胞凋亡率。结果 ①VP?16能抑制肺癌A549细胞的增殖，且呈量?效关系（r=-0.908,P<0.01），NIM与VP?16联用后，抑增殖作用增强，二者有相加或协同作用；②NIM及VP?16均可抑制A549细胞的生长，诱导凋亡，二者联用后作用增强。结论 NIM与VP?16联用可增强对肺癌细胞增殖的抑制和凋亡的诱导，二者具有协同抗肿瘤作用。

【关键词】  肺癌；凋亡；增殖；环氧化酶?2；依托泊苷

    The Effects of Nimesulide Combined with Etoposide on Lung Cancer Cell Proliferation and Apoptosis

     Key words：Lung neoplasm; Apoptosis; Proliferation; Cyclooxygenase 2; Etoposide

    近20 年来，肺癌已成为世界范围内发病率及病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康和生命。目前由于早期诊断技术的局限，约75%～80%患者就诊时已属晚期，有效的综合尤其是提高全身化疗疗效十分必要。环氧化酶?2（cyclooxygenase 2，COX?2）是前列腺素（prostaglandins，PGs）生物合成过程中一个重要的限速酶，与肿瘤发生关系密切，而COX?2抑制剂可增强一些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 [1]。本研究拟探讨COX?2抑制剂尼米舒利 (nimesulide, NIM)与肺癌常用化疗药依托泊苷（etoposide, VP?16）联用对肺癌细胞增殖与凋亡的作用，以期为肺癌的临床治疗提供基础理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养

    人肺癌细胞株A549（购自武汉大学典型生物冷藏中心），用含10%新生牛血清（武汉三利生物制品厂）、100u/mL青霉素及100u/mL链霉素的RPMI?1640培养基（Gibco公司），于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）消化传代。

    1.2  MTT比色法检测A549细胞增殖及增殖抑制率

    取对数生长期A549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200μL。24h后换液，设空白调零组：不接种细胞；对照组：只含等量溶剂；实验组：NIM（Sigma公司）25μmol/L与VP?16（山东齐鲁制药厂）2～32μg/mL联用，每组设6个复孔。培养48h后加入MTT（5mg/mL）20μL, 继续培养4h后吸出培养液，每孔加DMSO 150μL，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在ELX800酶标仪（美国Bio?Tek公司）上选择波长490nm，空白组调零，测定各孔吸光度A，细胞生长抑制率。抑制率＝（1－实验组A平均值/对照组A平均值）×100%。按以下公式计算Q值并判断两药的联合效应［2］：Q=E(A+B)/[EA+(1?EA)EB]，其中E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率。Q=0.85～1.15表示两药作用相加；Q>1.15表示两药作用协同；Q<0.85表示两药作用相互拮抗。

    1.3  描绘细胞生长曲线

    取对数生长期A549细胞按2×105 /mL接种于六孔板，24h后换液，分为4组，即对照组：未加药物；NIM组：NIM 25μmol/L；VP?16组：VP?16 8μg/mL；NIM + VP?16组 ：NIM 25μmol/L+ VP?16 8μg/mL。分别于干预后12h、24h、48h各取4孔，每孔4次记数，取其平均值，描绘生长曲线。

    1.4  流式细胞术检测细胞凋亡率

    取对数生长期A549细胞2×105/mL接种于培养瓶中，24h后换液，分组同1.3，各组均重复3瓶。培养48h后常规收集细胞，70%冷乙醇固定，-20℃保存。检测前PBS洗两次，RNA酶消化，PI避光染色30min，上流式细胞仪检测凋亡率。

    1.5  统计学处理

    计量资料用±s表示，SPSS11.0统计软件行单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  细胞增殖抑制率

    MTT比色法检测A值结果显示，见表1。VP?16单用时，即可抑制A549细胞的增殖（P均<0.01），随着浓度VP?16的增加，抑制作用增大，呈量?效关系（r=-0.908,P<0.01）；NIM与VP?16联用后，抑制作用增大，抑制率增加。我们的前期研究结果已证实，NIM浓度为25μmol/L时，其对A549细胞增殖的抑制率为10.85%[3]，根据公式计算Q值，结果显示NIM与VP?16联用有相加或协同作用（Q=1.10～1.25）。表1  VP?16、NIM+VP?16对肺癌A549细胞增殖的影响注：与对照组相比： * P<0.012.2  细胞生长曲线

    根据2.1实验结果，选用抑制率接近50%的VP?16浓度即8μg/mL作为VP?16组及NIM+VP?16组的干预浓度。由A549细胞生长曲线观察到NIM和VP?16可使生长曲线下移，二者联用后下移更为明显,见图1。提示NIM和VP?16对A549细胞生长有抑制作用，二者联用后，对细胞生长的抑制作用进一步加强。图1  A549细胞生长曲线

    2.3  细胞凋亡率

    流式细胞术结果显示，NIM、VP?16及NIM+VP?16组A549细胞凋亡率分别为（8.61±0.55）%、（14.90±1.90）%及（18.51±1.74）%，均高于对照组（4.13±0.31）%（P均<0.01）；且NIM+ VP?16组又高于NIM组及VP?16组（P <0.01，P<0.05）。提示NIM和VP?16均可有效地诱导A549细胞凋亡，二者联用后诱导凋亡作用增强。

    3  讨论

    化疗是中晚期恶性肿瘤的主要方法，由于肿瘤细胞的异质性、敏感性及耐药性等问题，疗效尚不令人满意，如何提高现有化疗药的疗效是近年来肿瘤治疗学的研究热点。研究发现，在一些恶性肿瘤化疗中加用COX?2抑制剂可起到增效作用。在表达或不表达COX?2的结肠癌细胞株，COX?2抑制剂NS?398和5?Fu联用可使生长抑制作用增强，提示NS?398 可作为结肠癌的辅助治疗[4]；而COX?2抑制剂依托度酸（etodolac）在体外虽不能提高5?Fu对结肠癌细胞LM?H3增殖的抑制效应，但体内实验则显示它与5?Fu联用可显著降低裸鼠结肠癌的肝转移[5]。还有实验结果表明，COX?2抑制剂JTE?522 (JT)与化疗药顺铂（CDDP）合用具有协同抗胃癌作用[6]，在乳腺癌、头颈部癌也有相似的研究报道[7，8]。提示COX?2抑制剂与常规化疗药联用是一个有希望的方法，值得进行更多的研究。

    化疗是中晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗方法，VP?16是临床常用的化疗药。VP?16是一种细胞分裂抑制剂，通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ，对细胞内DNA起作用，间接诱导DNA断裂，发挥细胞毒效应。NIM属甲磺酰胺类化合物，是选择性COX?2抑制剂。我们前期研究发现，NIM可抑制体内外肺癌细胞的生长[3]，本研究发现，VP?16单用时，对肺癌细胞增殖的抑制呈剂量依赖性；与NIM联用后，具有相加或协同作用；NIM和VP?16都可抑制肺癌细胞的生长并诱导凋亡，联用后肺癌细胞生长抑制更加明显。提示NIM与VP?16联用能增强对肺癌的细胞毒作用。

    目前，基础研究取得了令人鼓舞的结果，COX?2抑制剂作为肿瘤的辅助用药，已进入结肠癌、乳腺癌、肺癌等的Ⅱ期临床实验阶段[9?11]，并被认为具有增效作用。值得关注的是研究结果并不完全一致，Becerra等[12]用COX?2抑制剂Rofecoxib联合5?Fu治疗过表达COX?2的结肠癌时，患者上消化道出血、血小板减少、腹泻、恶心呕吐等副作用增多而抗癌疗效并未增强。说明，COX?2抑制剂与化疗药合用可能还存在着肿瘤细胞学和化疗药的差异性等问题，有待进一步探讨。

    总之，本研究发现COX?2抑制剂NIM与VP?16联用后，可增强对肺癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用，提示二者联用可能是提高肺癌疗效的一种有效方法。

【】
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