胃肠道间质瘤中PCNA和bcl?2蛋白的表达及临床意义

              作者：陶雪勤，熊永炎，姚兴凤

【摘要】  目的 探讨胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）中增殖细胞核抗原（PCNA）和bcl?2蛋白的表达与其发生及恶性转化的关系。方法 采用免疫组化SP法及彩色病理图像分析系统检测68例GIST组织中PCNA和bcl?2蛋白的表达。结果 68例GIST中，PCNA均呈阳性表达，其平均灰度值在良性组为144.95±3.37，潜在恶性组为139.54±4.91，恶性组为135.71±6.11，依次递减，即阳性表达水平逐渐增强，三者两两比较，差异均有显著性（P<0.05）。68例GIST中，bcl?2阳性表达者35例（51.47%），其平均灰度值在良性组为144.32±3.80，潜在恶性组为142.35±12.30，恶性组为140.35±12.06，三者两两比较，差异无显著性（P>0.05）。GIST中PCNA和bcl?2表达无明显相关性（P>0.05）。结论 细胞的增殖与凋亡的失衡是GIST发生恶性转化的重要机制之一。PCNA检测有助于判断GIST的性质；bcl?2在GIST早期阶段就参与了肿瘤的发生，但不能作为判断良恶性的指标。

【关键词】  胃肠间质瘤；PCNA；bcl?2；免疫组化；图像分析

    Expression of PCNA and bcl?2 in Gastrointestinal Stromal Tumors

     Corresponding Author: XIONG Yong?yanAbstract：Objective   To investigate the expression of PCNA and bcl?2 in gastrointestinal stomal tumors(GIST) and their correlations with the pathogenesis,development and differentiation degree of GIST.Methods  The expression of PCNA and bcl?2 were detected in 68 cases of GIST by immunohistochemical technique.Futhermore,multi?function precise color?image measure system was used for quantitative analysis.Results  All cases were positive for PCNA,the average gray in benign,potentially malignance and malignance were 144.95±3.37、139.54±4.91、135.71±6.11 respectively,there was a significant difference among the groups(P<0.05).Among 68 GISTs,35 cases expression bcl?2,the average gray in benign,potentially malignance and malignance were 144.32±3.80、142.35±12.30、140.35±12.06 respectively,but there was no significant difference among the groups(P>0.05).There was no significant correlation between PCNA and bcl?2(P>0.05).Conclusion  The unbalance of the cell proliferation and apoptosis is one of important mechanism in differentiation degree of GIST.The expression of PCNA is an important predicting maker for differentiation degree of GIST,but bcl?2 protein is not.

    Key words：Gastrointestinal stromal tumor; PCNA; bcl?2; Immunhistochemisty; Image analysis

    胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃肠道最常见的间叶性肿瘤，特异性表达c?kit（CD117）蛋白[1,2,4]。目前CD117和CD34的免疫组化染色已成为诊断GIST较为可靠的方法[1,2]。由于该肿瘤生物学行为的多样化，如何准确判断其良恶性尚缺乏明确指标。本实验应用免疫组化SP法和图像分析系统检测68例GIST中PCNA、bcl?2蛋白的表达，以探讨PCNA和bcl?2蛋白的表达水平及其与GIST的发生及恶性转化的关系。

    1资料与方法

    1.1研究对象

    本组病例为武汉大学中南病理科1995年1月～2003年10月间存档病例共68例，均根据光镜下形态特点，结合免疫组化染色结果（CD117阳性和/或CD34阳性）作出GIST的诊断。其中发生在胃和小肠分别为33例和22例，占80.9％，食管3例，结、直肠10例。肿瘤直径0.3～20cm，平均为6.04±4.23cm。男性37例，女性31例。年龄14～79岁，平均年龄55.57±14.12岁，40岁以上者57例，占83.8％。按下述GIST良、恶性诊断标准，良性14例，潜在恶性11例，恶性46例。按其形态学主要组成细胞成分分为：上皮样细胞型、梭形细胞型及混合细胞型三个亚型。

    1.2方法和试剂

    标本经4％甲醛固定，常规石蜡包埋连续切片（4μm），HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色切片经微波抗原修复，按SP法进行，DAB显色。抗bcl?2单克隆抗体及SP试剂盒为上海长岛生物技术公司产品，抗PCNA单克隆抗体为中山生物技术公司产品，均为即用型。以已知PCNA和bcl?2阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.3免疫组化染色结果判断

    PCNA阳性表达为细胞核着棕黄色，bcl?2阳性表达为细胞浆着棕黄色。所有染色切片在同一条件下应用HPIAS2000型彩色病理图像分析系统（同济千屏影像工程公司）进行相对灰度值的测定，随机选取3个高倍视野（4×100），其阳性表达水平应用平均灰度值表示，灰度值愈小其阳性表达水平愈高，反之则表达水平愈低。用±s表示每例平均灰度值。

    1.4GIST良恶性判断标准

    按Emory等[3]提出的标准将GIST分为良性、潜在恶性（交界性）及恶性。恶性指标有：(1）肿瘤具有浸润性；(2）肿瘤出现远、近脏器的转移。潜在恶性指标有：(1）胃间质瘤直径＞5.5cm，肠间质瘤＞4cm；(2）胃间质瘤核分裂＞5个/50HPF，肠间质瘤核分裂＞1个/50HPF；(3）肿瘤出现坏死；(4）肿瘤细胞有明显异型性；(5）肿瘤细胞生长活跃，排列密集。

    当肿瘤具备一项恶性指标或两项及两项以上潜在恶性指标时，则定为恶性GIST。仅有一项潜在恶性指标时，则定为潜在恶（交界）性GIST；不具备上述指标者则为良性GIST。

    1.5统计学方法

    应用SPSS12.0软件进行统计分析， 数据以±s表示，计量资料采用t检验或方差分析。

    2结果

    2.1PCNA在GIST中的表达及与临床病理因素的关系

    68例GIST中PCNA均呈阳性表达，其平均灰度值在良性组为144.95±3.37、潜在恶性组为139.54±4.91，恶性组为135.71±6.11，依次递减，即阳性表达水平逐渐增高。三者两两比较，阳性表达水平差异存在显著性（P<0.05）。但在不同组织学类型、部位、性别及年龄之间PCNA的表达水平差异无显著性，见表1。

    2.2bcl?2在GIST中的表达及与临床病理因素的关系

    68例GIST中bcl?2阳性表达者35例（51.47%），其平均灰度值为142.65±10.91。灰度值在良性、潜在恶性及恶性组分别为144.32±3.80、142.35±12.30和140.35±12.06，呈逐渐降低的趋势，即其阳性表达水平逐渐增强，经组间两两比较其表达水平差异无显著性（P>0.05）。此外，在不同组织学类型、部位、性别及年龄之间bcl?2的表达水平差异也无显著性，见表1。表1PCNA、bcl?2在GIST中的表达及与临床病理因素间的关系 注：与良性组比较*P=0.0001，与恶性组比较**P=0.044，与潜在恶性组比较△P=0.022.3GIST中PCNA表达和bcl?2表达的相关性

    对GIST中PCNA表达和bcl?2表达进行相关分析，Spearman相关系数值（rs）=0.217，P=0.212(P>0.05)，提示PCNA表达水平与bcl?2表达水平无相关关系。

    3讨论

    胃肠间质瘤是胃肠道最常见的间叶性肿瘤，特异性表达c?kit（CD117）蛋白。1998年Hirota等[4]发现GIST中存在c?kit（CD117）基因突变和蛋白特异性阳性表达。c?kit（CD117）是一种酪胺酸激酶跨膜受体蛋白，是骨髓原始造血干细胞标记物。CD34是一种骨髓造血干细胞抗原，可标记血管内皮细胞及其肿瘤，还能标记胃肠道及非胃肠道间质细胞及其肿瘤，是最早用于GIST诊断的标志物[5]。目前CD117和CD34的免疫组化染色已成为诊断GIST较为可靠的方法[1,2]。

    增殖细胞核抗原（PCNA）是一种分子量为3600的核蛋白，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，其表达、合成与细胞的增殖周期密切相关。它在细胞增殖周期G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期开始明显下降，M期降到最低。因此，PCNA能较好地反映细胞进入增殖周期的状况，客观地评估肿瘤细胞增殖和生长速度。研究表明，增殖细胞容易引起基因突变，并最终产生恶变。本研究中应用图像分析系统，以定量比较取代定性描述，以平均灰度值代替染色级别，发现68例GIST中PCNA均呈阳性表达，其平均灰度值在良性组为144.95±3.37,潜在恶性组为139.54±4.91，恶性组为135.71±6.11，依次递减，即阳性表达水平逐渐增强。三者两两比较，差异存在显著性（P<0.05），表明GIST恶性组比良性组有更高的增殖活性，更容易发生恶变。提示PCNA的检测在判断GIST恶性程度、预测预后方面具有一定的重要意义。即平均灰度值高者，阳性表达水平低，表明大部分肿瘤细胞处于G0期或静止期，DNA复制不活跃，增殖能力比较弱；相反，平均灰度值低者，阳性表达水平高，肿瘤细胞大部分处于增殖期，是增殖旺盛的表现。我们的实验结果与Panizo?Santis等[6]和Amin等[7]的报道一致。

    bcl?2是一种凋亡抑制基因，可抑制多种因素诱导的细胞凋亡，并在不影响细胞增殖的情况下增强细胞存活力，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，其介导的细胞凋亡障碍，使遗传物质的突变率增加，从而参与多种肿瘤的发生过程。对于bcl?2蛋白在GIST中表达的意义目前还存在争议。Cunningham等[8]发现，GIST中bcl?2阳性表达的患者其生存率要低于bcl?2阴性者，并认为bcl?2表达是GIST不良预后指标。Kontogianni等[9]研究却发现bcl?2蛋白表达与肿瘤生长缓慢显著相关，是提示GIST有较好预后的指标。本组GIST中，bcl?2阳性表达35例，其平均灰度值为142.65±10.91，表达水平在良、恶性组间差异无显著性，与组织学类型、部位、性别及年龄也无关，说明在肿瘤的良性阶段（即早期阶段）bcl?2就发挥作用，通过抑制细胞凋亡，使细胞数不断增多，增加基因突变的机会，促进肿瘤的发生。该结果与Panizo?Santis等［6］和Wong等[10]报道的结果一致。因此，本实验尚不支持bcl?2与GIST的恶性转化及预后有关的观点。

    细胞增殖与凋亡是组织正常生长、行使功能的两个基本要素，二者互相制约，处于动态平衡之中。平衡失调导致异常增殖，增殖细胞容易引起基因突变；而细胞不能正常凋亡势必引起细胞不断堆积，最终产生恶变。本研究结果显示，PCNA的表达水平与GIST的性质密切相关，而bcl?2的表达水平与此无关，且PCNA和bcl?2表达水平并无相关性，再次表明肿瘤细胞的增殖与凋亡的失衡也是GIST恶性转化的重要机制之一。

【】
  ［1］ Fletcher C,Berman J,Corless C,et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: A consensus approach [J].Hum Pathol,2002,33(5):459?465.

[2] Corless CL,Fletcher JA,Heinrich MC. Biology of gastroint?estinal stromal tumors [J].J Clin Oncol,2004,22(18):3813?3825.

[3]Emory TS,Sobin LH,et al.Prognosis of gastrointestinal smooth muscle (stromal) tumors: Dependence on anatomic site [J].Am J Surg Pathol,1999,23(1):82?87.

[4]Hirota S,Isozaki K,Moriyama Y,et al.Gain?of?function mutations of c?kit in human gastrointestinal stromal tumors [J].Science,1998,279（5350）:577?580.

[5]Miettinen M,Virolainen M,Maarit SR.Gastrointestinal stromal tumors?Value of CD34 antigen in their identification and separation from true leiomyomas and schwannomas [J].Am J Surg Pathol,1995,19(2):207?216.

[6]Panizo?Santos A,Sola I,Vega F,et al.Predicting metastatic risk of gastrointestinal stromal tumors: Role of cell proliferation and cell cycle regulatory proteins [J].Int J Surg Pathol,2000,8(2): 133?144.

[7]Amin MB,Ma CK,Linden MD,et al.Prognostic value of proliferating cell nuclear antigen index in gastric stromal tumors.Correlation with mitotic count and clinical outcome [J].Am J Clin Path,1993,100(4):428?432.

[8]Cunningham RE,Abbondanzo SL,Chu WS,et al.Apoptosis,bcl?2 expression,and p53 expression in gastrointestinal stromal/smooth muscle tumors [J].Appl Immunohistochem Mol Morph,2001,9(1):19?23.

[9]Kontogianni K,Demonakou M,Kavantzas N,et al.Prognostic predictors of gastrointestinal stromal tumors: a multi?institutional analysis of 102 patients with definition of a prognostic index[J].Eur J Sur Oncol,2003,29 (6): 548?556.

[10]Wong NACS,Young R,Malcomson RDG,et al.Prognostic indicators for gastrointestinal stromal tumours: a clinicopathological and immunohistochemical study of 108 resected cases of the stomach [J].Histopathology,2003,43(2):118?126.