肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase?3基因 的克隆与鉴定
【摘要】 目的 从长春新碱诱导发生自噬性凋亡的肝癌细胞系HepG2中克隆caspase?3基因。方法 提取细胞总RNA,采用RT?PCR技术扩增目的片段，构建重组克隆载体，测序鉴定及分析。结果 经RT?PCR获得了预期的扩增产物即caspase?3基因625bp的核苷酸片段，其测序结果与报道一致。 结论 初步证明该caspase?3基因片段参与了长春新碱诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程。
【关键词】 HepG2肝癌细胞系；自吞噬作用；细胞凋亡；长春新碱；caspase?3基因
细胞自噬（autophagy）与细胞凋亡（apoptosis）的调控机制有关，除了凋亡以外，自噬也可能是一种肿瘤抑制机制[1]。有着明显自噬特征的细胞凋亡称为“自噬性凋亡”（autophagic apoptosis）[2?4]。现认为caspase蛋白酶家族中的caspase?3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。本研究采用抗肿瘤药长春新碱（vincristine,VCR）诱导人肝癌细胞系HepG2自噬性凋亡，在此凋亡模型[4]基础上，试图从发生自噬性凋亡的细胞中克隆并鉴定caspase?3基因，以研究长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也与caspase?3有关。
1材料和方法
1.1细胞及培养
人肝癌细胞系HepG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10％小牛血清的RPMI-1640 (Gibco BRL) 常规培养。
1.2细胞分组与加药处理
细胞分3组：未加药对照组（药物为零剂量）、VCR（sigma）作用4h组、VCR作用16h组。VCR组的药物处理基本同文献[5]之自噬性凋亡细胞模型制作，即于培养细胞中加入1μg·ml-1的VCR进行诱导。各组分别于药物作用4h、16h后收获细胞继续以下实验。
1.3RNA分离
以TRIzol Reagent RNA 分离液(GIBCO BRL)提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定浓度后，将RNA样品作电泳质量分析后备用。
1.4caspase?3基因PCR引物的设计及合成
从“GeneBank”中查得的caspase?3基因cDNA序列[6]，应用引物设计软件“Oligo DNA/RNA Primer Analysis Software”设计一对caspase?3基因PCR引物为：上游:5’ATCATACATGGAAGCGAATC3’；下游：5’TGTCGGCATACTGTTTCA3’,理论上出其间长度为625bp。引物由上海生工公司合成。
1.5cDNA合成及引物扩增cDNA
用Gibco BRL THERMOSCRIPT RT?PCR System逆转录提取的RNA成cDNA；以之为模板行PCR，PCR循环参数为94℃ ，4 min→94℃，1 min；52℃，1min；72℃，3min；共40个循环后→72℃，5min。运用GAPDH作为内对照以半定量估计caspase?3 mRNA在总RNA中的水平。
1.6PCR反应产物电泳分析
以X174?HincⅡdigest DNA Marker为分子量参照，电泳2h后溴乙锭染色，紫外透射仪上观察照相。
1.7序列分析
回收RT?PCR产物,与pGEM?T vector质粒重组，抽提质粒，以重组质粒DNA为模板,3700?Bigdye?Terminator测序系统用M13正反向引物从两端行目的片段序列测定。经计算机DNASIS软件和BLAST软件根据GeneBank资料对目的DNA测序结果进行分析及基因同源性比较。
2结果
2.1总RNA电泳
从细胞中提取的总RNA经电泳鉴定可见清晰的18s、28s两条带。
2.2PCR扩增产物电泳
取PCR扩增产物电泳，结果可见两条清晰的扩增条带，一条为496bp的GAPDH内对照扩增产物带；另一条为目的基因扩增片断，大小为625bp，其片断大小与我们设计的理论预计值相符，未见非特异扩增带，见图1。
M：分子量标准；C：未加药对照组；4h：VCR 4h组；16h：VCR 16h组。GAPDH分子量大小为496bp
图1caspase?3 mRNA RT?PCR扩增产物的电泳鉴定
2.3PCR扩增片段核苷酸序列测定结果
对扩增片段测序结果测出625bp核苷酸片段，与设计的引物间核苷酸片段长度一致。
2.4核苷酸序列同源性检索及比对
引物间核苷酸序列与Genebank报道的caspase?3序列（检索号为NM_004346）同源性为100%。用Blast软件行序列分析结果显示引物间核苷酸序列与报道的CPP32β/Yama(caspase?3)cDNA序列完全一致，见图2。
3讨论
经过一系列研究，作者认为“自噬性凋亡”是细胞凋亡的一种特殊类型，自噬性凋亡有着明显的自噬特征[2?4]。其他一些学者也对细胞凋亡作了类似的分类，并认为自噬才是这类细胞凋亡的真正原因[7]。
现普遍认为半胱天冬酶类(caspases)是凋亡信号传导的共同通路，该蛋白酶家族成员之一的caspase?3在其中起着核心作用[5]。为了阐明长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也依赖于caspases，作者进行了上述实验，在已建立的长春新碱诱导HepG2细胞自噬性凋亡之细胞模型基础上，试图从发生自噬性凋亡的细胞中克隆caspase?3基因。
长春新碱属于长春碱类抗肿瘤药，据报道这类药物可诱导细胞自噬的发生，也能诱导肿瘤细胞凋亡[8,9]。HepG2细胞在VCR诱导之后先后出现两个阶段的变化：自噬阶段和凋亡阶段。自噬阶段发生于VCR作用的初期，并贯穿整个细胞变化过程；而凋亡阶段主要出现于VCR处理8h之后，在药物作用16h时凋亡细胞数量达到很高的程度［4］。作者分别以3组不同的HepG2细胞总RNA为模板，经RT后在caspase?3的特异引物引导下进行PCR扩增，625bp的扩增产物其大小与设计的caspase?3基因片段相符，结果并显示VCR作用4h组、16h组的细胞中均有caspase?3 mRNA的表达。并可看出，从VCR作用4～16h即从自噬到自噬性凋亡过程中，caspase?3的mRNA表达呈增强趋势。本实验采用GAPDH作为内对照，三组样本均获得同样的GAPDH扩增产物带,说明用于RT?PCR的三组起始RNA的量基本相同，所获结果具有可比性。
将PCR扩增产物经测序及同源性比较分析后的结果表明，分离得到的基因片断与Genebank报道的caspase?3 基因序列完全一致，提示作者从VCR诱导的自噬性凋亡HepG2细胞中克隆的基因片断为caspase?3基因片断。虽然实验获得的只是caspase?3的一段序列，但该实验证明caspase?3参与了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡。caspase?3基因可能是该自噬性凋亡的枢纽元件。自噬和凋亡可能使用着某些共同的调节机制[10]，自噬的抑制可以影响长春新碱诱导的肝癌细胞自噬性凋亡[4]。自噬也可能是一种肿瘤抑制机制，自噬及自噬性凋亡的调控可能均与肿瘤的调控机制有关。
【】
［1］ Gozuacik D,Kimchi A.Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism［J］.Oncogene,2004，23（16）:2891?2906.
[2]朴英杰，胡雯，黄行许，等.γ射线照射による淋巴球のautophagic apoptosis について［J］.显微镜，1997,32（2）：140?145.
[3]彭心昭，陈英，朴英杰，等.自噬的抑制影响长春新碱诱导的肝癌细胞自噬性凋亡［J］.肿瘤，2004,24（1）：32?35.
[4]彭心昭，陈英，朴英杰，等.长春新碱诱导的自噬性凋亡对线粒体膜电位的影响［J］.医学物杂志,2001，18（1）：37?39.
[5]Boatright KM,Salvesen GS.Mechanisms of caspase activation［J］.Curr Opin Cell Biol,2003,15(6):725?731.
[6]Tewari M,Quan LT,O'Rourke K,et al.Yama/CPP32 beta a mammalian homolog of CED?3,is a crmA?inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP?ribose) polymerase［J］.Cell,1995,81（5）:801?809.
[7]Yue Z，Horton A,Bravin M,et al.A novel protein complex linking the 2 glutamate receptor and autophagy: implications for neurodegeneration in lurcher mice［J］.Neuron,2002,35（5）:921?933.
[8]Groninger E,de Graaf SS,Meeuwsen?de Boer GJ,et al.Vincristine?induced apoptosis in vivo in peripheral blood mononuclear cells of children with acute lymphoblastic leukaemia (ALL) ［J］.Br J Haematol,2000,111（3）:875?878.
[9]郭德玉,卞修武,辛容,等.5?氟尿嘧啶、长春新碱与去甲二氢愈创木酸配伍对人恶性胶质瘤细胞株的作用［J］.肿瘤防治研究,2002,29(1):50?52.
[10]Camougrand N,Grelaud?Coq A,Marza E,et al.The product of the UTH1 gene,required for Bax?induced cell death in yeast,is involved in the response to rapamycin［J］.Mol Microbiol,2003,47（2）：495?506.
