人突变p27基因对大肠癌细胞凋亡的影响

            作者：徐少勇,陈珺,熊玲,王家宁，黄永章

【摘要】  目的 探讨人突变p27基因对大肠癌细胞凋亡的诱导作用。方法 构建重组腺病毒Ad?p27mt，转染大肠癌细胞SW480，用流式细胞仪、DNA片段分析法、TUNEL法观察Ad?p27mt对大肠癌细胞的凋亡的诱导作用。结果 成功构建了Ad?p27mt，在感染复数≥50时，可达100%的转导效率。Ad?p27mt转染SW480。24h后流式细胞仪检测在G1期前出现了亚二倍体凋亡峰，细胞DNA提取电泳后出现了凋亡特征性梯带，TUNEL法检测凋亡指数实验组和对照组分别为（82.0±3.2）和（5.0±3.5），差异有显著性（P<0.01）。结论 人突变p27基因能有效诱导大肠癌细胞的凋亡。

【关键词】  大肠癌；p27mt基因；细胞凋亡

基金项目：湖北省基金资助项目
       1.Department of Gastroenterology,Remin Hospital;Yunyang Medical college,Hubei  Shiyan 442000,China,2.Institute of Clinical MedicineAbstract：Objective   To study the inducing effect of human mutant p27 gene on apoptosis of the colorectal cancer cells.Methods  The recombinant Adenovirus Ad?p27mt was constructed to infect the colorectal cancer cell SW480.The inducing effect of Ad?p27 mt on apoptosis of the colorectal cancer was measured by the flow cytometer,the DNA fragment analysis and TUNEL method.Results  Ad?p27mt was successfully constructed.If the multiplicity of infection (MOI) was ≥50,the infection efficiency can reach 100%.After 24h of infection,there was an apoptotic hypodiploid peak on the flow cytometer before G1 and there were apoptotic characteristic bands in the DNA electrophoresis.The apoptotic index detected by TUNEL method was 82.6±3.2 (Ad?p27mt group) and 5.0±3.5 (control group) respectively,the difference of which was significant (P<0.01).Conclusion  Human mutant p27 gene can effectively induce apoptosis of the colorectal cancer cells.

    Key words：Colorectal carcinoma; p27mt gene; Apoptosis

    细胞周期调控的失常与肿瘤的形成密切相关。p27是一种多功能细胞周期素依赖激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI),主要通过阻止细胞周期G0/G1期至S期的转换，实现对细胞周期的负性调控，进而阻止细胞的增殖和肿瘤的形成[1,2]。本研究构建了重组p27mt的E1区缺失的复制缺陷性腺病毒，用以转染大肠癌细胞株SW480，观察其在细胞中的表达及对SW480细胞周期、凋亡的影响。旨在探讨大肠癌的新途径。

    1资料与方法

    1.1主要试剂 

    人p27mt重组腺病毒（Ad?hp27mt）由本科构建[3]。LacZ重组腺病毒（Ad?LacZ）由王家宁博士构建[4]，鼠抗人p27kip1多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体购自北京中山公司。SW480购自武汉大学典型物保藏中心。Western blot检测试剂盒为美国KPL公司产品。

    1.2方法

    1.2.1大肠癌细胞SW480的培养

    100ml/L FCS、RPMI1640培养基37℃、50ml/L CO2培养箱中培养，待细胞铺至70%～80%时用于实验。

    1.2.2 X?gal的化学染色

    取15cm培养瓶中可用于实验的SW480细胞，按20、40、50、100的感染复数（multiplicity of infection，  MOI）转染Ad?LacZ 48h后，经5ml/L戊二醛固定15min，PBS洗3次后，加X?gal染液染色,37℃ 50ml/L CO2培养箱中孵化4～24h显微镜下观察蓝染细胞（即LacZ基因表达的阳性细胞），分别蓝染细胞的百分率。

    1.2.3p27mt基因表达的检测

    取75cm培养瓶中用于实验的SW480细胞，分别用Ad?p27mt（MOI  100）和Ad?LacZ（MOI  100）转染。同样条件下48h后，分别将细胞用0.5g/L胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗2次。1×SDS?PAGE 细胞裂解液500μl裂解后，煮沸5min，离心取上清，行Western blot检测。

    1.2.4Ad?p27mt转染细胞后流式细胞仪检测

    取75cm培养瓶中用于实验的SW480细胞，用Ad?p27mt（MOI  100）转染SW480，48h后收集细胞，PBS洗2次。取100μl细胞悬液，加DNA?PREPTM LPR200μl混匀，室温避光3min后加入DNA?PREP stain 1000μl染色试剂（PI染色）混匀，15min后，在Counter Epics XL流式细胞仪上检测，分析细胞周期及细胞凋亡。设Ad?LacZ组(MOI  100)和空白对照组（不加病毒正常培养的SW480细胞）作为对照。

    1.2.5DNA片段化分析分别收集用Ad?p27mt和Ad?LacZ转染48h后SW480细胞及空白对照组细胞，1000r·min-1离心5min，去上清，在细胞沉淀中加入500μl细胞裂解液裂解,经酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀DNA,700ml/L乙醇洗一次，200μl TE溶解DNA，再加入RNA酶（终浓度50μg/ml）,37℃过夜。10g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。

    1.2.6细胞凋亡的TUNEL分析 将1×104细胞悬液接种于放有盖玻片（经清洗和高压灭菌）的60mm平皿中，分为Ad?p27mt和空白对照组，每组接种6块玻片，细胞孵育24h后，取出盖玻片，用1×PBS洗2次，甲醇∶冰乙酸（3∶1）固定30min后，按试剂盒说明操作。结果判断，每张切片计数1000个细胞，求均值，计算其凋亡指数（Apoptosis index,AI），即100个癌细胞中的凋亡细胞数。

    1.2.7统计学分析数据用SPSS 11.5软件进行处理，均数用±s表示，均数差异显著性用t检验。

    2结果

    2.1X?gal化学染色

    用Ad?LacZ转染SW480后，通过X?gal染色对腺病毒介导的基因转移率进行评估，结果显示当MOI≥50时，感染率为100%，表明重组腺病毒在体外能有效地介导基因向SW480中转移。

    2.2人突变p27重组腺病毒体外转染SW480后p27蛋白表达

    将可用于实验的SW480细胞用Ad?p27mt（MOI：100）感染24h后收集细胞，用1×SDS×PAGE裂解液裂解细胞后100℃煮沸5min，离心取上清，用美国KPL公司的TMB系统Western blot检测试剂盒对蛋白进行检测，经TMB染色后，Ad?p27mt转染的细胞呈高表达，而Ad?LacZ和正常对照组仅有微量（内源性）27KD的蛋白质表达，说明本实验所构建的人突变p27重组腺病毒在SW480中可正确表达p27基因，并在细胞内实现了蛋白产物的高表达，见图1。

    1:未转染的SW480细胞；2:Ad?lacZ转染的SW480细胞；3:Ad?p27mt转染的SW480细胞

    图1Western blot检测p27蛋白的表达

    2.3Ad?p27mt对大肠癌细胞凋亡的诱导

    SW480经Ad?p27mt、Ad?LacZ及不加病毒处理24h后，经流式细胞仪检测，实验共重复6次，亚二倍体的均值分别为：41.0%、4.67%及1.96%。经检验Ad?p27mt组与Ad?LacZ及不加病毒组比较有显著性差异（P<0.01），见图2。

    ①:非感染的SW480细胞；②:Ad?lacZ转染的SW480细胞；③:Ad?p27mt转染的SW480细胞

    图2流式细胞仪检测细胞的凋亡

    2.4DNA片断化检测

    DNA电泳表明，Ad?LacZ组及正常对照组基因条带完整，Ad?p27mt转染组可见明显的180?200bp为倍数的“梯形”条带，符合凋亡特征性改变,见图3。

    1:Marker;2:空白对照组；3:Ad?lacZ组；4，5:Ad?p27mt组

    图3DNA片段分析检测细胞凋亡

    2.5TUNEL法检测细胞凋亡

    凋亡细胞核呈浓染，深褐色，胞浆浓缩，体积变小。Ad?p27mt组与空白对照组凋亡指数分别为（82.6±3.2）%及（5.0±3.5）%，经检验有显著性意义（P<0.05）,说明Ad?p27mt能明显诱导大肠癌细胞的凋亡，见图4。

    2.6外源性p27mt对细胞周期的影响

    SW480细胞经不同处理后检测细胞周期的结果，见表1，从表中可以看出Ad?LacZ组与正常对照组G0/G1细胞逐渐减少，S期细胞比例上升，表明细胞周期转换时间短暂，增殖活跃。而Ad?p27mt组，G0/G1期细胞比例显著增高，S期比例下降，与正常对照组和Ad?LacZ组比较均有显著差异（P<0.001），细胞周期被阻滞于G0/G1期。表1Ad?p27mt对SW480细胞周期的影响

　　3讨论

    目前，重建抑癌基因功能已成为肿瘤基因的合理策略。p27蛋白的降解，主要由泛素介导的p27的187位苏氨酸磷酸化引起[5?7]。野生型p27(即p27kip1)表达的蛋白中187?190位保留羟基末端（COOH?Terminal）是CDK的目标磷酸化位点，本课题将野生型p27的187位苏氨酸和188位脯氨酸分别置换成蛋氨酸和异亮氨酸，产生了突变p27mt(mutant type)。本课题构建了携带p27mt的复制缺陷重组腺病毒，用于大肠癌细胞株SW480的凋亡研究。实验发现突变p27转染大肠癌细胞SW480后,通过p27多克隆抗体检测到了p27的高表达，说明携带p27mt重组的腺病毒能够将目的基因导入癌细胞。通过流式细胞仪检测，Ad?p27mt组的凋亡率达41.0%,与对照组比较有显著性意义(P<0.01)。与相关实验[1]比较发现p27mt比p27wt能更加有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，结果与报道一致[8]。通过DNA片段检测，出现了符合凋亡的180?200bp的梯状条带。通过TUNEL法进行检测，凋亡指数达82.6%,与对照组比较有显著性意义(P<0.05)。结果表明，p27基因是大肠癌发生的一个重要基因，p27表达下调可能是细胞分化和凋亡障碍的一个主要原因，通过突变p27基因,而上调p27表达可更加有效地促进癌细胞的凋亡，为大肠癌的治疗提供了新的方法。细胞周期结果表明，p27mt使大肠癌细胞增殖明显抑制，控制细胞由G1期进入S期，发生了G1/S期阻滞，其机制是直接抑制cyclin/CDK的激酶活性，cyclin/CDK的浓度是细胞通过G1?S限制点的关键因素； Winteringham等[9]认为p27的积累参入了在启动分化时使细胞周期停滞的效应机制。

    本研究利用突变p27基因成功诱导了大肠癌细胞的凋亡，并且凋亡率明显高于其他文献[1]报道的野生p27转染癌细胞的凋亡率，这为大肠癌的基因治疗提供了非常有用的重建抑癌基因的实验依据，在体内的作用效果以及凋亡机制本课题将进一步探讨。

【文献】
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[3]陈珺,徐少勇,邓长生,等.细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒[J].第四军医大学学报，2004，25（5）：406?409.

[4]王家宁，黄永章，孔霞，等.细菌内同源重组快速构建和制备表达β?半乳糖苷酶的重组腺病毒[J].郧阳医学院学报，2004，23（1）：1?5.

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