KDR mRNA在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义
【摘要】 探讨血管内皮生长因子受体?2（KDR）与微血管密度表达与非小细胞肺癌（NSCLC）生物学行为与预后的关系。方法 分别应用原位分子杂交及免疫组织化学方法检测62例NSCLC和16例肺良性瘤样病变组织中的KDR mRNA、MVD的表达。结果 （1）NSCLC与肺的良性瘤样病变MVD、KDR mRNA的表达具有显著性差异（P＜0.01 ），肺癌MVD随KDR mRNA 表达增强而增多，两者呈正相关。（2）MVD和KDR mRNA的表达在肺腺癌高于肺鳞癌（P＜0.01）两者随淋巴结转移、TNM分期的进展而升高（P＜0.01）。（3）生存期＜5年者MVD和KDR mRNA的表达显著高于生存期＞5年者（P＜0.01）。结论 MVD和KDR mRNA的表达与NSCLC的发生、、转移关系密切，可以作为评估NSCLC生物学行为及预后判断的指标，KDR可能成为NSCLC的一个潜在的抗血管生成的靶点。
【关键词】 血管内皮生长因子受体?2 非小细胞肺癌 原位分子杂交 微血管密度
0 引言
肺癌的侵袭和转移是患者治疗失败和死亡的主要原因，而新生血管的生成是肺癌侵袭和转移的解剖学和生基础，血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）及其受体?2（Kinase domain?containing receptor , KDR/VEGFR?2/Flk?1）在促进内皮细胞的分裂与增殖，促进血管生成中起着关键作用。许多肿瘤及其血管内皮细胞均有KDR表达升高，KDR表达水平与血管内皮细胞的更新速度呈正相关。
本研究应用原位分子杂交技术检测非小细胞肺癌（Non?small cell lung cancer, NSCLC）中KDR mRNA的表达，应用免疫组化S?P法检测微血管密度（Microvascular density, MVD）的表达，试图探讨KDR mRNA的表达对MVD的影响,以及KDR mRNA 表达与临床病理特征及预后的相关性，以探测KDR的作用机制，为NSCLC的抗血管生成治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料 选用1999年3月至2000年3月我院心胸外科手术切除并经病理学确诊的NSCLC 标本62例，其中男44例，女18例；年龄37～76岁，平均55.9岁。所有患者术前均未行放疗和化疗，经影像学检查确认无远处转移。按WHO《肺肿瘤组织学分型》（1981）标准，包括肺鳞癌27例，肺腺癌35例。组织学分级为Ⅰ级7例，Ⅱ级25例，Ⅲ级30例。按UICC（1997）肺癌分期标准，包括Ⅰ期17例，Ⅱ期10例，Ⅲ期33例，Ⅳ期2例。肿瘤长径为1.8㎝～11.0㎝，平均5.0㎝ 。有淋巴结转移39例，无淋巴结转移23例。其中42例有完整随访资料，生存期≤5年者32例，＞5年者10例。另选同期肺良性瘤样病变16例（其中结核球11例，炎性假瘤3例，浆细胞肉芽肿1例，纤维软骨脂肪瘤1例）组织标本作对照。
1.2 主要试剂 CD34鼠单抗、免疫组化S?P试剂盒和DAB显色试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司，KDR mRNA原位杂交试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 实验方法 石蜡块标本制成4μm切片，原位分子杂交采用胃蛋白酶暴露mRNA核酸片断，参照试剂说明书进行，以细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性杂交信号，少量胞核也有阳性信号，无阳性信号为阴性。免疫组织化学染色程序按S?P试剂盒说明书进行，同时用已知的阳性切片在同条件下染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。
肿瘤MVD的测量应用HPIAS－2000型全医学彩色图像分析系统分析处理。参照Weidner方法[1]，先在低倍光镜（×20，×100）下扫描整张切片，确定3个高血管密度区，即“热点”，再在高倍镜（×400）下计数被染成黄色的微血管数目，结果用3个高倍镜视野下微血管数目的平均数表示。
1.4 统计学处理 使用SPSS11.5统计软件包，两个均数之间的比较用student t 检验，计数资料用χ2检验 。
2 结果
2.1 MVD与NSCLC NSCLC组织内微血管密度分布，相互间联系紧密，MVD平均为43.78±12.46；肺良性瘤样病变微血管分布均匀且少，MVD平均为7.42±4.12 ，NSCLC较肺良性瘤样病变显著升高（P＜0.01）（表1）。从表1还可以看出，肺腺癌组织MVD明显高于鳞癌组织（P＜0.05），Ⅲ＋Ⅳ期组MVD明显高于Ⅰ＋Ⅱ期组（P＜0.05），有淋巴结转移组MVD明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05），而不同组织学分级与肿瘤大小间无显著性差异。
2.2 KDR mRNA与NSCLC KDR mRNA 阳性信号以胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒判断（图1、2）。由表1可见，KDR mRNA表达在肺癌高、中、低分化组织中依次上调，低分化、中分化肺癌组织中阳性表达率较高分化显著升高，差异有显著性（P＜0.05）。TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期病例中KDR mRNA表达阳性率 80％（39 / 45）高于Ⅰ＋Ⅱ期病例的58.82％（10 / 17），差异有显著性（P＜0.01）。有淋巴结转移者表达阳性率较阴性组差异有显著性（P＜0.05）。肿瘤大小间KDR的阳性表达率差异也有显著性（P＜0.05）。而KDR mRNA表达阳性率与肺癌的病理类型无明显相关关系（P＞0.05）。
图1 鳞癌KDR mRNA （×100）（略）
图2 腺癌KDR mRNA （×100）（略）
2.3 MVD和KDR mRNA表达与NSCLC预后 从表1可见，生存期＜5年组的MVD明显高于生存期＞5年组（P＜0.01）；同样，生存期＜5年组的KDR mRNA的阳性表达率亦明显高于生存期＞5年组（P＜0.05）。
表1 MVD、KDR mRNA和NSCLC临床生物学的关系（略）
2.4 MVD与KDR mRNA表达的关系 62例NSCLC中，KDR mRNA（＋）49 例，KDR mRNA（—） 13例；KDR mRNA（＋）者MVD为51.72±6.71，KDR mRNA（—）者MVD为 44.03 ±10.84 ，KDR mRNA表达阳性者MVD较KDR mRNA表达阴性者明显升高（P＜0.01）。见表2。
表2 KDR的表达与微血管密度（MVD）的关系（略）
3 讨论
肿瘤的血管新生成是一个包括血管内皮溶解，内皮细胞增殖和迁移及血管腔形成的复杂过程，并且是由促进和抑制血管生成的正负相关因子共同调控的复杂过程。在生理状况下，正负因子处于平衡状态。而肿瘤在其生长、演进过程中分泌促血管生成的相关因子，将平衡打破，诱导血管新生。肿瘤血管生成过程中VEGF及其受体KDR起重要作用。KDR与VEGF的亲和力为Kd752770Pm,具有明显的化学趋化作用和促分裂活性，而Flt?1缺乏此活性[2..3]。人在胚胎和出生时的脑血管也可有KDR表达，但成年后明显减少。VEGF基因显性阴性研究表明KDR与血管岛、血管形成和造血有关，提示KDR是血管生成的主要调控因子[4]。VEGF具有强烈的诱导血管内皮细胞表达其受体的作用，VEGF及其受体通过自分泌或旁分泌途径，联合调控内皮细胞分化与血管形成。由于实体瘤的生长与转移对血管新生的依赖性，VEGF及其受体已成为近年来抗血管生成的重要研究靶点。
本研究结果显示，NSCLC中MVD和KDR mRNA表达明显高于肺良性瘤样病变（P＜0.05），MVD随KDR表达增强而增多，两者呈正相关，与Koukourakis等[5] 报道一致。提示在NSCLC中存在着活跃的血管生成，KDR作为VEGF的的最重要的功能受体，KDR在介导肿瘤血管新生方面起重要的作用。
KDR在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤患者预后的关系，目前仍然存在较大的争议，Delmotte等[6]进行的meta分析发现，VEGF可以作为预测NSCLC患者的预后指标，而KDR作为NSCLC患者的预后指标的证据不足，但Decaussin等[7]的研究表明，KDR mRNA的表达水平与肺癌组织中的血管生成呈正相关，而与NSCLC患者的生存期呈负相关。Harada等[8]认为KDR可以作为结直肠癌患者的预后指标。本研究发现，KDR mRNA表达水平与NSCLC患者的生存期呈负相关，且可以作为预测NSCLC的预后指标。
综上所述，肺癌组织中KDR mRNA表达明显高于良性病变组织，且与肺癌大小、淋巴结转移状况和PTNM分期呈正相关(P＜0.01） ，而与癌细胞分化程度呈负相关。KDR mRNA阳性表达组的5年生存率显著低于阴性表达组，从而提示KDR参与了肺癌的发生与肺癌的恶性程度密切相关，可以作为肺癌生物学行为的一项评估指标。而且KDR mRNA的表达阳性者较KDR mRNA表达阴性者的MVD数目显著增加，提示KDR可能成为NSCLC的一个潜在的抗血管治疗的靶点。
【】
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［7］ Decaussin M, Sartelet H, Robert C, et al. Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its two receptor(VEGFR?1/Flt?1 and VEGFR?2/Flk?1/KDR) in non?small cell lung carcinomas(NSCLCs): correlation with angiogenesis and survival[J]. J Pathol, 1999, 188(4):369?77.
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