多西他赛联合放疗对大鼠脊髓损伤的观察

              作者：杨月琴，金伟，邹丽娟，赵瑾瑶，邵淑娟

【摘要】  目的 探讨多西他赛联合放射对大鼠脊髓损伤的影响。方法 将40只Wistar品系大鼠随机分为5个组，即空白组、多西他赛组、放疗组、先多西他赛后放疗组和先放疗后多西他赛组。多西他赛组单次腹腔注射多西他赛5mg/kg。放疗组、先多西他赛后放疗组和先放疗后多西他赛组采用Varian 2300 C/D直线加速器6MeV线照射大鼠胸段脊髓， 照射野为2cm×4cm，5Gy/次，隔日1次，总剂量为40Gy。联合组多西他赛与照射的间隔时间为3d。照射结束后5个月，行活体灌注固定，取材，光镜和电镜观察脊髓的形态学变化。结果 光镜下，放疗组和先多西他赛后放疗组白质部分坏死；先放疗后多西他赛组白质大片坏死。后2组均见胶质细胞核固缩。各组灰质内神经元和血管未见变化。电镜下，各组脊髓髓鞘改变程度不一。 放疗组脊髓髓鞘板层结构水肿、粘连，模糊不清。先多西他赛后放疗组的脊髓髓鞘的板层结构部分松解、扭曲；胶质细胞核固缩。先放疗后多西他赛组脊髓损伤髓鞘的板层结构大部分松解、扭曲、断裂；细胞器严重变形；胶质细胞凋亡。各组血管均未见明显改变。结论 多西他赛与放疗联用明显加重脊髓损伤，且放疗后加用多西他赛脊髓损伤加重。

【关键词】  脊髓损伤；化学疗法；多西他赛；放射疗法   

    Key words：Spinal cord injury；Chemotherapy；Docetaxel；Radiotherapy

    目前，用于和放疗联合治疗肿瘤的化疗药物很多，其中多西他赛(docetaxel)是抑制各种肿瘤效果较好的化学试剂，临床上单独或与其他化疗药物合用与放疗联合成为多种癌瘤的主要治疗方案[1?4]；但多西他赛合并脊髓区放疗对脊髓损伤影响的资料较少。本实验通过Wistar大鼠观察多西他赛合并脊髓区放疗的脊髓损伤程度，为临床多西他赛并用放疗提供理论指导依据。

    1  材料与方法

    1.1  主要药品与设备

    多西他赛（齐鲁制药有限公司，20mg/支）、苏木素、伊红、戊二醛、四氧化俄、Epon812 包埋液、LA?40模拟定位机、Varian 2300C/D医用直线加速器、AVS?410滑台切片机、OLYMPUS光学显微镜、KLB?Ⅴ型超薄切片机、JEM?3000EX透射电子显微镜。

    1.2  实验动物与分组

    本实验采用大连医科大学动物实验中心提供的Wistar品系健康雄性大鼠40只，体重(220±34)g，按组间均衡设计，分为空白组、多西他赛组、放疗组、先多西他赛后放疗组和先放疗后多西他赛组，以体重进行均衡检验后，5组间无差异。

    1.3  注射和照射方法

    在放射治疗前3天对多西他赛组和先多西他赛后放疗组大鼠单次腹腔注射docetaxel 5mg/kg。3天后，分别对放疗组、先多西他赛后放疗组和先放疗后多西他赛组3组大鼠进行照射。用自制的固定装置固定大鼠，在模拟定位机下拍正位和侧位X片，测出脊髓的深度，同时确定胸段照射范围，左右宽度包括整个椎体，射野大小为2cm×4cm，用放疗科专用药水在大鼠照射野中心剪毛后作标记，使每次照射都能重复相同的照射范围。采用加速器的6MeV电子线照射，单次照射剂量为5Gy，根据脊髓的深度换算出6MeV照射时的机器跳数，剂量率为300c Gy/min，固定源皮距（SSD）技术照射，SSD = 100cm，隔日1次，共8次，照射总剂量为40Gy。8次照射结束后3天，先放疗后多西他赛组大鼠单次腹腔注射docetaxel 5mg/kg。

    1.4  取材

    于照射结束后5个月，用 3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用 4%多聚甲醛加1.25%的戊二醛进行活体灌注，从背部暴露脊髓，小心分离出照射部位脊髓，分成2段，上段切成约1cm3的组织块固定于5%福尔马林溶液中；下段切成约1mm3的组织块固定于2.5%戊二醛中。

    1.5  光镜观察

    将固定于5%福尔马林溶液中的脊髓组织块，经乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡切片，HE染色，光镜观察。

    1.6  电镜观察

    将固定于2%戊二醛中的脊髓组织块， 经1%俄酸双固定，磷酸缓冲液清洗，乙醇脱水，Epon812包埋液常规浸透、包埋，半薄切片，经甲苯胺蓝染色，光镜下定位，超薄切片，再经铀?铅盐双染色，透射电镜下观察。

    2  结果

    2.1  光镜观察各组脊髓形态变化

    光镜下，空白组的大鼠脊髓白质（图1）和灰质（图2）。多西他赛组白质内部分有髓神经纤维排列紊乱（图３）。放疗组灰质内神经元、胶质细胞、血管未见明显改变（图４），白质出现部分坏死（图５）。先多西他赛后放疗组白质部分坏死（图６）；灰质内神经元、血管未见明显改变，胶质细胞核固缩（图７）。先放疗后多西他赛组白质出现大片坏死（图８），灰质内胶质细胞核固缩，神经元、血管未见明显改变（图９）。

    2.2  电镜观察各组脊髓病理变化

    空白组正常大鼠脊髓髓鞘为同心圆板层排列，密实有序，线粒体饱满（图10）。多西他赛组部分髓鞘结构出现板层结构松解、扭曲等轻度变化，细胞器相对完好。放疗组髓鞘的板层结构水肿、粘连，模糊不清（图11），血管未见改变（图12）。 先多西他赛后放疗组髓鞘的板层结构部分松散 (图13)；胶质细胞核固缩（图14）；血管未见改变（图15）。先放疗后多西他赛组脊髓损伤程度严重，表现为正常髓鞘的板层结构大部分松解、扭曲、断裂；细胞器严重变形（图16）；胶质细胞凋亡（图17）；血管未见改变（图18）。

    3  讨论

    脊髓放射性损伤是放射治疗的晚反应之一。由于它危害大，而且具有不可逆性，越来越引起人们的重视。但是由于脊髓的放射性损伤出现的时间晚，研究周期长，目前资料较少[5]。本实验观察大鼠放射后脊髓损伤改变的结果表明，每次5Gy、隔日1次、总剂量40Gy的分次方案，总剂量虽然低于脊髓的耐受剂量45Gy，仍然导致了比较严重的脊髓损伤，符合脊髓是晚反应组织，对大的分次剂量敏感的特征，即大的分次剂量降低了脊髓的耐受量[6,7]。

    脊髓放射性损伤主要发生在白质，光镜下表现为部分白质坏死，电镜下表现为髓鞘板层结构水肿、粘连，模糊不清，灰质和血管未见明显改变。放化疗联合实验组结果表明：多西他赛和放疗合用组脊髓损伤比单纯多西他赛组和单纯放疗组脊髓损伤加重，并且先放疗后多西他赛组脊髓损伤比先多西他赛后放疗组重，表现为大片白质坏死；超微结构可见髓鞘板层结构大部分松解、扭曲、断裂；细胞器严重

    图10  空白组大鼠脊髓髓鞘超微结构(标尺200nm)   图11  放疗组大鼠脊髓髓鞘超微结构(标尺1μm)  图12  放疗组大鼠脊髓血管超微结构(标尺1μm)    图13  先多西他赛后放疗组大鼠脊髓髓鞘超微结构(标尺1μm)图14  先多西他赛后放疗组大鼠脊髓胶质细胞超微结构(标尺1μm)  图15  先多西他赛后放疗组大鼠脊髓血管超微结构(标尺2μm)  图16  先放疗后多西他赛组大鼠脊髓髓鞘超微结构(标尺2μm)  图17  先放疗后多西他赛组大鼠脊髓胶质细胞超微结构(标尺1μm)  图18  先放疗后多西他赛组大鼠脊髓血管超微结构(标尺1μm)

    变性； 神经胶质细胞出现凋亡。 多西他赛联合放疗对脊髓损伤目前尚未见报道。 在以后的实验中， 我们将进一步用免疫组化和RT?PCR法分析大鼠脊髓损伤后NF、 MBP、GFAP、 p53等的表达情况。

    多西他赛是一个独特的抗肿瘤药物，其具有与其他化疗药物不同的作用机制，主要通过与微管蛋白结合，促进微管双聚体装配而防止去多聚化过程，抑制微管网的正常动力学重组，导致纺锤体形成障碍，干扰正常细胞的有丝分裂，细胞周期延长，细胞增殖周期阻滞于放射敏感的G2～M期，产生异常多倍体细胞，导致细胞凋亡，并有抗血管生成的作用[8?10]。多西他赛与放疗的联合可能正是由于大部分细胞在G2～M期对放射敏感，而多西他赛可使大部分细胞在G2～M期阻滞后死亡，两者取得同步作用，导致了脊髓损伤的加重。

    尽管多西他赛对放疗有增敏作用，能增加肿瘤的放射敏感性，提高肿瘤的效果，但是通过本实验我们发现，多西他赛与放疗联用加重脊髓晚期损伤。这一结果提示，多西他赛与放疗联用时应注意放疗剂量，并注意放化疗的顺序。

【】
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