威灵仙注射液对骨关节炎模型动物软骨组织形态和胶原表达的影响
作者： 陈飞雁，王旭，黄加张，夏军，顾湘杰
【关键词】 骨关节炎
摘 要：［目的］探讨威灵仙注射液对骨关节炎模型动物关节软骨的组织学、胶原表型和超微结构的作用。［方法］建立骨关节炎动物模型，动物随机分为3组，S组、D组和K组，S组和D组分别注射威灵仙注射液和生理盐水，K组空白。分批处死动物取关节软骨标本，常规石蜡切片，HE／SOFC双染色，Mankin评分比较各组关节软骨损伤程度。免疫组化法（IHC）检测各组关节软骨基质Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达情况。透射电镜（TEM）观察各组关节软骨超微结构变化。［结果］S组在各时段的评分均优于D组和K组；S组在各时点Ⅰ型胶原阳染面积低于D组和K组，Ⅱ型胶原阳染面积高于D组和K组；S组软骨在各时间点损伤程度都低于D组和K组，K组和D组损伤程度基本一致。［结论］威灵仙注射液可维持和促进软骨合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原，对关节软骨具有保护作用。
关键词：骨关节炎； 威灵仙注射液； 组织学； Ⅱ型胶原； 超微结构
Abstract：［Objective］To study the effect of sixpetal clematis root injection（WLX）on histology,collagen phenotype and ultramicrostructurc in cartilage of osteoarthritis animal model［Method］OA model animals were randomly divided into 3 groups:group S,group D and group KAnimals in group S received WLX and animals in group D received sterilized normal saline intramuscularly,group K was control and received nothingAfter the animals were killed,cartilage specimen were obtained and sections were made and stained with HE/SOFG for Mankin score;the expression level of collagen Ⅰ and Ⅱ in matrix was tested by immunohistochemistry;change of ultramicrostructure of cartilage was observed with transmission electron microscope［Result］Mankin score in group S was better than that in group D and K at each test period;result of IHC shows that positive stain area of collagen Ⅰ was lower in group S than that in group D and K,and positive stain area of collagen Ⅱ was higher than that in group D and K at each test period;cartilage impairment degree in group S was lower than in group D and K,and impairment manifestation in group D and K was similar on the whole［Conclusion］sixpetal clematis root injection may protect articular cartilage by maintaining and promoting the chondrocyte synthesizing proteoglycan and type Ⅱ collagen
Key words：Osteoarthritis； WLX； Histology； Type Ⅱ collagen； Ultramicrostructure
骨关节炎（OA）是一种多因素引起的以关节软骨退行性变为基本病理改变的疾病。延缓关节软骨退变和促进透明软骨再生是防治OA的关键。目前尚缺乏OA的特异性方法。中药威灵仙是治疗风湿痹痛的传统药物，威灵仙注射液（WLX）临床用于治疗OA数十年，却少有确切作用机理的探讨。作者在以往的实验中建立了OA动物模型并且证实WLX能够降低OA模型动物关节液与体外培养软骨细胞分泌IL-1β的水平〔1〕。本研究观察WLX对OA关节软骨的组织学、胶原表型以及超微结构的影响作用。
1 材料和方法
11 动物分组和造模
健康成年新西兰大白兔45只，雄性，体重24~26 kg，随机编为3组即WLX实验组（S组）、生理盐水对照组（D组）和空白对照组（K组），每组15只，参照Hulth法建立动物模型，术后术侧肢体不固定，分笼饲养。
12 药物干预方法
WLX，2 ml／支（含生药1 g／ml，复旦大学附属华山制剂室提供）。按MeehRubner公式兔子体表面积：A（体表面积m2）=k（系数）×W（体重g）2／3／10 000。成人每日威灵仙常规用量为4 ml，根据成人与兔子体表面积比值推算得兔子WLX用量为04 ml・d-1。术后第2 d起S组：WLX 04 ml・d-1肌注，D组：NS 04ml・d-1肌注，K组：不用药，连续4周。
13 光镜标本制备
于术后6、12、24周每组随机取5只兔，过量麻醉法处死，以S06、S12、S24代表S组6、12和24周；D组、K组类推。切取负重关节面全层软骨，10％中性缓冲甲醛固定，5％甲酸甲醛脱钙1周，石蜡包埋切片，HE／SOFG（番红O-固绿）染色，中性树脂封片，光镜观察，按Mankin评分标准评分。
14 免疫组化染色（IHC）
切片脱蜡至水，3％过氧化氢室温下10 min，抗原修复液37 ℃ 2 min，山羊血清封闭液10 min。依次加入一抗（oncogene）37 ℃ 22 h；二抗（生物素标记IgG，Boster）37 ℃ 20 min；链霉素抗生物素蛋白过氧化酶溶液（Boster）37 ℃ 30 min；DAB显色，甲基绿复染，中性树脂封片，Olympus BH2光镜观察，阳性染色结果为软骨细胞外基质出现棕黄染色。标本在光镜下用视野检测面积进行校正（每份标本计数6个切片，每个切片取3个视野），LeicaQw 550图像分析软件定量分析，结果以阳性染色面积比例（PAR）表示，PAR=（阳性染色面积／总面积）×100％。
15 透射电镜观察（TEM）
动物处死后迅速用锋利刀片切取内侧股骨髁负重面1 mm×1 mm×1 mm软骨，NS冲洗，4 ℃ 25％戊二醛固定2 h，10％ EDTA脱钙3周，1％锇酸固定2 h；4 ℃冰箱内乙醇逐级脱水后环氧树脂包埋，超薄切片（50~60 nm），铅铀双染色，JEM1200EX透射电镜观察；描述分度见表1。表1 透射电镜软骨组织形态学描述分度
分 度 形态学描述正常及轻度损伤 胶原纹理清晰，铰链较为紧密，可见周期性横纹；细胞呈梭形或椭圆形，胞核完整，核膜清晰，染色质分布均匀，胞浆密度均匀或轻度增加，部分出现空泡，可见内质网、线粒体等细胞器中度损伤 胶原纹理尚清晰，铰链出现紊乱；细胞缩小，胞核变形，有分离现象；胞膜出现不连续现象，胞浆丢失严重，可见大量脂滴或囊泡；胞周出现较多致密颗粒重度损伤 胶原纹理不清，呈颗粒状外观，铰链现象不明显；细胞轮廓不清晰或消失，胞核消失，细胞裂解为大量致密的颗粒状物，有向陷窝一角聚集的倾向16 统计分析
Mankin评分结果和IHC检测结果用SPSS 110统计学软件行单因素方差分析，多组间两两比较，结果以x-±s表示，P＜005为差别有显著意义，P＜001为差别有非常显著意义。
2 结 果
21 光镜观察和Mankin评分结果
S06组软骨面光滑，细胞排列和形态基本正常，番红O（SafraninO）染色表层淡，移行层和深层染色较深，潮线完整；D06和K06组软骨表面溃疡，局部细胞弥漫增生簇集，细胞周围SafraninO深染，潮线基本完整。S12组软骨变薄，有溃疡或裂隙，局部细胞簇集，SafraninO表层淡染，移行层和深层染色深，潮线不完整；D12组软骨明显变薄，溃疡深至移行层，中深层细胞簇集，SafraninO染色中重度减少，部分可见双重潮线；K12组和D12组表现相似。S24组软骨结构破坏较严重，细胞数量明显减少，SafraninO染色重度减少，部分软骨ECM不着色，潮线破坏；K24组和D24组表现相似，软骨结构细胞数量显著减少，大部分ECM无SafraninO染色，潮线破坏并可见钙化层与软骨下骨的破坏（图1）。Mankin评分结果见表2。
22 IHC检测结果
221 Ⅰ型胶原
S06组仅见表层阳性染色，PAR较低；S12组中、深层少量阳性染色，PAR高于S06组；S24组PAR进一步增高。D06组各层ECM中散在阳性染色，PAR高于S06组；D12组PAR显著高于S12组；D24组各层均见散在的阳性染色，以浅表层染色最深，PAR高于S24（图2）。K组和D组表现一致。统计结果见表3。表2 Mankin评分结果
22 Ⅱ型胶原
S06组Ⅱ型胶原阳性染色广泛均匀地分布于软骨各层；S12组阳性染色不均匀，表层阳染减少，移行层到钙化层阳染部分区域加深，PAR高于S06；S24组阳性染色显著减少。D06组染色不均，表层阳染减少，移行层至钙化层见散在的阳染加深区；D12组阳染显著减少；D24组阳染面积广泛减少，PAR水平进一步降低。K组结果与D组基本一致（图3）。统计结果见表4。
23 TEM检测结果见表5、图4表4 Ⅱ型胶原PAR百分率
3 讨 论
31 WLX对OA关节软骨组织学水平的影响
OA软骨光镜下表现为表面不光滑，龟裂或溃疡、剥脱，软骨纤维化，软骨基质SafraninO染色减弱，潮线可被血管破坏，出现双重潮线。SafraninO可以和软骨基质蛋白多糖（PG）结合显色，反映软骨PG的合成代谢能力〔2〕。实验发现，S组动物在各个时间点的软骨基质对SafraninO的异染性均优于D组和K组，提示WLX在体内对软骨细胞PG表型的表达具有维持和保护作用。Choi〔3〕等应用绿茶提取SKI306XHulth骨关节炎模型兔的实验显示SKI306X可以显著减少OA软骨PG的丢失。万荣〔4〕等在黑虎丹治疗兔骨关节炎的实验研究中发现该药能促进中晚期OA软骨细胞增殖和PG的合成。上述实验中SKI306X具有抑制IL1β的作用，黑虎丹具有祛风湿活血的作用，WLX同时具有祛风湿和抑制IL1β的作用〔1〕，推测其作用机理除了抑制细胞因子IL1β之外，可能还与WLX中含有微量促进软骨细胞PG合成的有效成分如皂甙、棕榈酸等有关〔5〕。
32 WLX对软骨基质胶原表型的影响
在OA发生过程中，胶原破坏所造成的结果是决定性的，Ⅱ型胶原是正常关节软骨基质的特征性胶原表型，OA时软骨基质Ⅱ型胶原表达水平降低并可表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原〔5〕，本实验选择Ⅰ型和Ⅱ型胶原作为观察软骨基质胶原表型的标志物。结果WLX能够在翻译水平维持基质胶原的正常表达，延缓异常胶原表达的出现，提示造模后应用WLX早期干预在翻译水平能有效缓解基质胶原降解破坏的程度，延缓OA的发生发展。对照组早期Ⅱ型胶原表达和分泌增加是软骨的一种代偿修复反应，这和Matyas等〔7〕研究的结果是一致的。Stoop等〔8〕研究显示IL1β等细胞因子可以诱导软骨细胞分泌MMPs，从而导致软骨胶原不可逆转的的损害。推测WLX可能是通过降低IL1β等炎性细胞因子对软骨细胞的作用从而减少MMPs的分泌，有效防止了基质胶原的降解。
33 WLX对OA关节软骨在超微结构水平的影响
OA发展各时期的关节软骨超微结构可以发生显著的改变，结合〔9〕本文将关节软骨的损伤分为：轻度-早期，中度-中期，重度-后期，由于正常成年兔关节软骨可开始出现退行性变，故将正常和轻度损伤放在同一个度上。有研究显示，关节软骨的表型标志物-Ⅱ型胶原是通过标准基因途径系统在粗面内质网合成的，另一重要标志物PG则是通过特殊的糖系统合成的。6周时S组软骨细胞的细胞器丰富，核仁清晰，粗面内质网发达，而对照组已经出现轻到中度的损伤，说明在WLX作用下创伤后6周的关节软骨仍保持较旺盛的胶原与PG合成代谢能力；12周和24周时S组超微结构始终优于D组和K组。超微结构水平也提示WLX具有保护和维持软骨细胞合成胶原与PG的作用，与组织学和IHC的结果相一致。
34 WLX的原材料威灵仙作为祛风湿类药物对于风湿及类风湿性关节炎、肩周炎、坐骨神经痛等多种疾病均有显效，本院自制WLX是威灵仙经蒸馏提取的注射液，临床对膝关节OA的治疗有效率为679%〔10〕，WLX中起抗炎止痛作用的主要有效成分是白头翁素和原白头翁素，具有抗炎、镇静、解痉等作用。其质量控制标准是采用紫外分光光度法测定所含白头翁素的含量。近年来的研究显示WLX中含有多种复杂的成分，包括黄酮类、皂甙、酚类、挥发油、棕榈酸、异阿魏酸、三萜化合物等。异阿魏酸（isoferulic acid）和β谷固醇（βsitosterol,BSS）可以抑制细胞因子白介素β的产生并调节T淋巴细胞、NK细胞的活性，从而发挥抗炎止痛作用〔11〕，某些皂甙可能还具有促进蛋白多糖合成的作用。因此，WLX防治OA的作用机理相当复杂。
综上所述，WLX主要通过以下途径对OA产生防治作用：含有促进软骨细胞合成代谢的有效成分，促进和维持软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖；抑制IL1β等细胞因子，有效阻止IL1β及其下游分子对软骨的损伤效应。但WLX并不能从根本上阻止因机械应力改变导致的OA发生以及最终发展为晚期OA的结局。由于WLX的成分复杂，经肌肉注射在体内代谢后真正的有效成分是什么，促进软骨合成作用的具体机理如何都有待进一步的深入研究。
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