恶性骨肿瘤来源成纤维母细胞促进溶骨作用
作者： 孙嗣国，马保安，周勇，张明华，范清宇
【关键词】 破骨细胞
摘 要：［目的］检验恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞是否能够支持破骨细胞分化及其溶骨作用。［方法］酶消化法从肿瘤组织中分离成纤维母细胞并作体外培养。细胞传代后，一部分成纤维母细胞与外周血单核细胞共培养，分别加入MCSF、骨保护素（OPG）及抗TNFα中和抗体。同时，作者还应用了Transwell系统检验可溶性促溶骨性因子的表达。培养结束后检测抗酒石酸磷酸酶（TRAP）的表达及骨吸收陷窝的形成，并比较各组细胞的骨吸收活性。另一部分成纤维母细胞单独培养，RTPCR法检测其细胞核因子кB受体活化因子配体（RANKL）和TNFα mRNA的表达。［结果］在MCSP存在的条件下，2种细胞共培养组分别于14、21 d观察到TRAP阳性的多核细胞和骨吸收陷窝形成；大剂量OPG彻底阻断TRAP阳性多核细胞及骨吸收陷窝的形成，而大剂量抗TNFα中和抗体对成纤维母细胞支持的破骨细胞形成未显示抑制作用。RTPCR结果显示恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够表达RANKL和TNFαmRNA。［结论］在MCSF存在的条件下，恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞通过表达RANKL支持破骨细胞分化及其溶骨作用。
关键词：破骨细胞； 溶骨作用； 细胞核因子кB受体活化因子配体； 成纤维母细胞
Abstract：［Objective］To investigate whether fibroblasts from malignant bone tumor could support osteoclast differentiation and bone resorption［Method］Fibroblasts isolated from 8 fresh tumor samples were cultured in vitroAt passage two,part of these fibroblasts were cocultured with peripheral blood monocytesMCSF,OPG and neutralizing antiTNFα antibody was added to the culture respectivelyA Transwells system was also applied to observe the secretion of solvable factors in fibroblastsAt day 1,day 14 and day 21,the cultures on coverslips and bone slices were stopped and examined for the formation of tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）positive multmucleated cells（MNCs）and lacuna resorption pits respectivelyThe number of lacuna resorption pits on bone slices,which was a marker of OC activity,was compared between the groupsAnother part of the fibroblasts were cultured alone,and RTPCR was performed to investigate the expression of RANKL and TNFα mRNA in the fibroblasts［Result］TRAP positive MNCs and lacuna pits were observed in the coculture group in the presence of MCSF,but not in the absence of MCSEIt was also the case in the Transwell group,even though the number of lacuna pits was resucedOPG completely inhibited the formation of TRAP positive MNCs and lacuna pits,while antiTNFα had not inhibiting effect on this processRTPCR results showed that both RANKL and TNFα mRNA were positive in all the fibroblast involved［Conclusion］In the presence of MCSF,fibroblasts from malignant bone tumor are capable of supporting osteoclast formation and activity through expression of RANKL
Key words：Osteoclast; Osteolysis； Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand; Fibroblasts
骨质破坏、疼痛及高钙血症是恶性骨肿瘤最常见的临床表现，其机理还不明确。越来越多的证据表明破骨细胞（osteoclastOC）所介导的溶骨作用在此过程中起关键作用〔1〕。
OC是由单核巨噬系统的前体细胞分化而来的TRAP阳性的多核细胞，骨吸收作用是其特征性标志。OC的分化及活性受多种因素调节，其中细胞核因子кB受体活化因子配体（RANKL）／细胞核因子кB受体活化因子（RANK）/骨保护素（OPG）起最主要作用〔4〕。在RANKL／RANK机制之外，还存在TNFα、IL6等炎性因子诱导的OC分化途径〔5〕。目前认为，TNFα、IL6途径主要是在肿瘤、炎症等病理条件下对OC起重要作用。但无论是哪一种机理，MCSF都是不可或缺的重要因子。
实验证明肿瘤细胞能够激活，OC并支持其溶骨作用〔2、3〕。然而肿瘤组织内除肿瘤细胞外，还存在大量的成纤维母细胞。本试验旨在研究恶性骨肿瘤组织来源的成纤维母细胞是否能够支持OC分化和溶骨作用及其分子机制。
1 材料和方法
11 材 料
αMEM（Invitrogen,UK）中加入100 IU／ml青霉素，10 μg／ml链霉素和10 mmol L谷氨酸（Invitrogen,UK）及10％胎牛血清（MEM／FBS）（Gibco Laboratories，UK）。乙二胺四乙酸钠、重组MCSF和抗TNFα中和抗体购于R&D systems，Inc（UK）。Ⅰ型胶原酶及RANKL拮抗剂RANK：Fc购自SigmaAldrich Chemicals（UK）。RANKL和OPG由Afsie Sabokbar博士（Nuffield Orthopaedic Centre，University of Oxford,UK）惠赠。所有的细胞培养均在37 ℃、5% CO2条件下进行。抗酒石酸磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购于SigmaAldrich Chemicals（UK）。RNeasy Mini kit RNA提取试剂盒购于Qiagen（UK）。cDNA合成试剂盒购于Gibco Laboratories（UK）。PCR引物由R&D systems，Inc（UK）合成。
12 成纤维母细胞的分离和培养
新鲜肿瘤组织标本取自8名在Nuffield骨科中心行手术的骨肿瘤患者（6名男子和2名女子；年龄14~45岁），其诊断均经术后病理检查证实（软骨肉瘤3例；骨肉瘤5例，其中1例同时患有畸形性骨炎）。将标本切成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，加入适量Ⅰ型胶原酶在37 ℃条件下在摇床上消化45 min，加入等体积乙二胺四乙酸钠在相同条件下消化35 min;滤网去除残留组织块，收集滤液300 g离心10 min；MEM／FBS重悬细胞并将细胞悬液加入35 ml培养瓶，孵育2 h后更换培养液，以后每周更换培养液2次；待细胞长满后按1∶5传代。待细胞覆盖培养瓶90％时收集细胞，一部分与PBMCs共培养，另一部分用于提取RNA。
13 外周血单核细胞（PBMCs）的分离
新鲜全血由8名健康成年男子〔（30±6）岁〕提供。将外周血按1∶2稀释于MEM后缓慢加到Histopaque（Sigma Che micals，UK）上层，离心（693 g）30 min。吸取处于界面层的细胞，重悬于MEM并离心（600 g）10 min，重复2次，然后重悬于MEM／FCS。体积分数为005（5％）的醋酸溶解红细胞后，细胞记数板记数PBMCs。事先将灭菌的直径4 mm的皮质骨磨片和直径6 mm的玻璃盖玻片分别放入96孔细胞培养板，并加入100 μl MEM／FBS。将PBMCs（5×105／孔）加入该细胞培养板，孵育2 h后将皮质骨磨片及玻璃盖玻片取出并在MEM／FCS中充分涮洗以去除非黏附细胞；然后转移到的24孔组织培养板中培养，每孔含2块玻璃盖玻片或3块象牙磨片。
14 细胞共培养及实验分组
对于PBMCs与成纤维母细胞共培养组，向上述孵育PBMCs的24孔细胞培养板各孔中分别置入1×104成纤维母细胞；对于Transwell组，将1×104成纤维母细胞置于Transwell的聚碳酸酯膜小室内。加入各种因子并调整MEM／FBS使各孔内溶液体积为1000 μl。每3 d更换培养液及各种因子。
实验分组：A组：PBMCs+成纤维母细胞共培养；B组：PBMCs+成纤维母细胞+25 ng／ml MCSF；C组：PBMCs／成纤维母细胞+25 ng／mlCSF+100 ng／ml OPG；D组：PBMCs+成纤维母细胞+25 ng／ml MCSF+100 ng／ml antiTNFα；E组：PBMCs+成纤维母细胞／25 ng/ml MCSF，成纤维母细胞置于Transwell小室内；P组（阴性对照组）：PBMCs+25 ng／ml MCSF；G组（阳性对照组）：PBMCs+25 ng／ml MCSF+30 ng／ml RANKL。
15 破骨细胞的鉴定
151 TRAP染色
于24h、第14d终止玻璃盖玻片上的细胞培养，按照试剂盒提供商的要求分别固定后进行TRAP染色。
152 骨吸收陷窝的鉴定
于24h、第21d终止象牙磨片上的细胞培养，将象牙磨片浸泡于NH4OH（1 mol/L）30 min、超声波处理去除黏附的细胞及碎片后，蒸馏水润洗并于空气中凉干;05％甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下检测虫蚀样骨吸收陷窝的形成，并取3块象牙磨片上骨吸收陷窝数量的平均值作为该组陷窝的数量。
16 成纤维母细胞总RNA的提取和RTPCR
取15×106成纤维母细胞，应用RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒并按照提供商要求提取总RNA。取2 μg总RNA按照试剂提供商要求反转录合成cDNA，再各取1 μl cDNA为模板进行PCR扩增RANKL和TNFα，PCR反应条件见表1。PCR产物经1％琼脂糖电泳后，Phosphor Imager（Molecular Dynamics,CA）采集图像。
17 统计学分析
对各组骨吸收陷窝的数量间进行比较时采用单因素方差分析，并应用SPSS 110软件包对数据进行分析。P＜005时认为差异有显著性。
2 结 果
21 成纤维母细胞支持PBMCs分化为具有骨吸收活性的MNCs
为了排除所获取的PBMCs中混有OC，作者于24 h终止细胞培养，结果未见TRAP阳性的多核细胞（MNCs）或虫蚀样骨吸收陷窝形成。其余的细胞培养分别于14、21 d后终止。结果显示，阳性对照组（G组）见大量TRAP阳性MNCs的及虫蚀样骨吸收陷窝形成；而阴性对照组（F组）则未见TRAP阳性的MNCs或虫蚀样骨吸收陷窝形成。
在不加入MCS条件下，成纤维母细胞与PBMCs共培养（A组）也未见TRAP阳性的MNCs或虫蚀样骨吸收陷窝形成。在25 ng／ml MCSF存在的条件下，成纤维母细胞与PBMCs接触性共培养（B组）观察到TRAP阳性MNCs（图1a）和象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝形成（图1b）。为了检验成纤维母细胞是否能够分泌可溶性因子支持OC分化及其骨吸收作用，作者在实验中应用了聚碳酸酯膜Transwell（E组）。聚碳酸酯膜可以允许可溶性因子自由通过同时又避免2种细胞直接接触。培养结束后Transwell组也观察到了TRAP阳性MNCs和虫蚀样骨吸收陷窝形成。与接触性共培养（B组）比较，Transwell组象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的数量显著减少（P=3556E5）（表2）。
为了弄清成纤维母细胞支持PBMCs分化为破骨细胞的分子机理，作者分别向共培养细胞内加入RANKL的饵受体OPG和TNFα中和抗antiTNFα。结果OPG完全阻断TRAP阳性的MNCs和虫蚀样骨吸收陷窝形成；而antiTNFα组未能完全阻断TRAP阳性MNCs的形成，但是显著抑制象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成（P=0014）（表2）。表1 PCR 引物序列、反应条件及扩增的目的片段大小
3 讨 论
尽管恶性骨肿瘤导致骨质破坏、恶性疼痛及高钙血症的确切机理还不清楚，然而已有研究表明它与OC分化及生物活性调节的异常有关〔1〕。在恶性骨肿瘤的病变过程中，肿瘤组织内的肿瘤细胞及炎性细胞通过分泌RANKL、TNFα、PGE2等分子直接或间接作用于OC及其前体细胞，从而促进OC介导的溶骨作用〔1、6〕。肿瘤组织内除肿瘤细胞、炎性细胞外，还有大量的成纤维母细胞存在。本实验中，作者不但证实恶性骨肿瘤组织来源的成纤维母细胞能够支持人OC前体细胞分化成为具有骨吸收活性的OC，而且作者还采用了Transwell系统将这2种细胞进行非接触性共培养，从而证实恶性骨肿瘤组织来源的成纤维母细胞能够分泌可溶性因子支持OC分化及其溶骨作用。Transwell组骨吸收陷窝的数量显著少于2种细胞接触性共培养组，提示可溶性因子在肿瘤来源的成纤维母细胞支持OC分化及活性过程中仅起到了一小部分作用。
RANKL／RANK机理是OC分化及骨吸收活性的主要调控机理。RANKL是肿瘤坏死因子超家族成员，以膜结合蛋白和可溶性RANKL（sRANKL）2种形态存在于体内。RANKL通过与破骨细胞前体细胞及成熟的破骨细胞表面的RANK结合而促进破骨细胞的分化与骨吸收活性。OPG是RANKL的饵受体，它通过竞争性结合RANKL而阻断RANKL与RANK间的相互作用，从而抑制破骨细胞的分化与活性。很多因子通过调节RANKL/OPG的比率而调节体内的骨吸收作用〔4〕。RANKL主要表达于活化的T淋巴细胞和成骨细胞。Julian等的研究表明脾脏、肺组织等来源的成纤维母细胞能够表达RANKL并支持OC分化及其骨吸收活性〔7〕。作者近期的研究显示松动人工假体周围假膜组织内的成纤维母细胞能够支持破骨细胞分化〔8〕的实验表明，恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够表达RANKL mRNA。细胞培养的结果进一步表明恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够通过细胞间接触以及分泌可溶性因子2种途径支持OC的分化及骨吸收活性；而且大剂量OPG则完全阻断OC的分化及骨吸收活性，这提示这一过程主要是通过RANKL／RANK机理完成。
尽管OC的分化与活性主要受RANKL／OPG调控，然而在病理条件下（如恶性骨肿瘤）TNFα的表达增加，异常表达的TNFα对OC介导的溶骨作用也起到重要作用。TNFα不但能够与RANKL在OC生物调控过程中起协同作用〔9〕，而且能够单独诱导OC的分化并支持成熟OC的骨吸收活性〔5〕。另有研究表明〔10〕，TNFα还能够调节成骨细胞等细胞中RNAKL的表达从而间接地参与OC的调控。但是在作者的实验中，虽然恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞表达TNFα mRNA，但是大剂量的TNFα中和抗体antiTNFα并未抑制成纤维母细胞支持的溶骨作用。这表明TNFα在恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞支持OC分化及骨吸收活性的过程中不起主要作用。然而，作者并不排除TNFα通过其他途径（如调节其他细胞中RANKL的表达等）参与调节恶性骨肿瘤相关的溶骨作用的可能。
总之，作者的试验结果显示恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够通过表达RANKL支持OC前体细胞向OC分化，并且促进成熟的OC的骨吸收活性。在恶性骨肿瘤导致的骨质破坏过程中，成纤维母细胞可能通过类似机理发挥重要作用。因而针对成纤维母细胞支持的溶骨作用的措施有可能成为治疗恶性骨肿瘤导致的骨质破坏及肿瘤性疼痛新的切入点。
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