降钙素防治骨质疏松模型兔的人工假体无菌性松动的实验研究
作者：李锋，方忠，熊伟，李光辉
【关键词】 骨质疏松
摘 要：［目的］探讨降钙素对已行人工假体植入骨质疏松模型兔的假体无菌性松动防治作用的实验研究。［方法］将30只假体植入模型的骨质疏松症兔随机分成实验组和对照组，各15只。实验组给予鲑鱼降钙素（6 U／kg，肌注，隔日1次），而对照组给予等量的生理盐水肌注，持续治疗半年。两组均分别于术前、术后4、8、12和24周检测假体周围感应区（ROI）骨密度（BMD）；于术前及术后4、12、24周行血清骨代谢指标检测：骨特异性碱性磷酸酶（BALP）、骨钙素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP5b）；所有动物于术后24周处死，分别行假体拔出实验与扭转实验测定和假体周围骨组织形态计量学分析。［结果］术后24周，实验组假体周围局部感兴趣区BMD增加近5％，而对照组假体周围局部感兴趣区BMD下降了6％，两组比较有显著性差异（P＜001）；骨代谢指标中，术后24周实验组的BALP、BGP稍有下降，但组内无显著性差异（P＞005），而TRAP5b有明显下降（P＜005），这些指标与对照组比较差异显著（P＜005或P＜001）；生物力学检测显示，实验组的假体拔出实验较对照组提高了约50％，扭转实验提高近1倍，且两组比较差异显著（P＜001）;骨组织形态计量学显示，实验组中反映骨吸收的OcNo／TbPm、ES／BS明显减少；反映骨量和微结构的％TbAr、TbN明显增多，而TbSp明显变窄：反映骨形成与骨矿化的OS／BS、MAR、BFR／TV及％LPm也均明显增多；这些指标与对照组比较差异显著（P＜001或P＜005）。［结论］鲑鱼降钙素能明显减少人工假体周围骨量的丢失和抑制骨溶解；并加快假体周围的骨形成，提高骨密度，促进生理性骨矿化；还能改善骨质量，促进骨微结构改变，提高骨的生物力学特性并增加假体四周的支撑力。其对骨质疏松症兔的假体松动有明显的预防和治疗作用。这对临床预防和治疗人工关节的无菌性松动有很好的指导意义。
关键词：降钙素； 骨质疏松； 假体； 无菌性松动
Abstract：［Objective］To investigate the prevention and treatment of the aseptic loosening of prosthesis for the rabbits of osteoporosis by the salmon calcitonin［Method］Thirty osteoporosis female rabbits which had been set up the models of the arthroplasty were divided into two groups randomly;one received salmon calcitonin,and the other placebo as control for 6 monthsThe BMD of the region of interested（ROI）around the prosthesis was detected before the operation and after 4,8,12 and 24 weeks of the operation;the BALP,BGP and TRAPSb in reflecting bone metabolism were observed before operation and after 4,12,24 weeks of operationAll rabbits were sacrificed after 24 weeks of implantationSpecimens of right femur were sectioned to be studied by biomechanical test and histomorphometry［Result］The BMD of ROI for the experimental group increased by 5%,however that of the control decreased by 6%Among the bone metabolism,the BALP,BGP and TRAP5b showed lower,specially the TRAP5b（P＜001）compared with the controlThe pullout strength of the experimental group was 15 times than that of the control and the torsion strength was 2 times,while there was a significant difference（P＜001）on this aspectsThe result of histomorphometry showed the bone loss decreased and the ministructure of bone（%TbAr,TbN,TbSp）became better;the remodel of trabcular（OS/BS,MAR,BFR/TV,%LPm）increased obviously and the bone resorption（OcNo/TbPm,ES/BS）decreased,and there were a significance on all the aspects between the two groups（P＜001 or P＜005）［Conclusion］The therapy of salmon calcitonin can decrease the bone loss and the bone resorption around the prosthesis,increase the BMD of ROI,accelerate the formation of bone and the good change of the bone ministructure,and change the quality of bone with the better aspects of bone biomechanical test and the stabilities of prosthesisThe salmon calcitonin can inhibit aseptic loosening of prosthesis in rabbits and it chould be a good drug for the prevention and treatment of aseptic loosening prothesis for the rabbits of osteoporosis
Key words：Calcitonon; Osteoporosis; Prosthesis; Aseptic loosening
随着社会人口老龄化，骨质疏松性髋部骨折发生会越来越多，且其致残、致死率较高，对此类骨折，大多采取内固定或人工全髋置换术。而全髋置换术后的假体无菌性松动是目前临床处理较为棘手的问题之一。降钙素以其较强的抑制骨吸收，减少骨量的丢失，而常用于骨质疏松症治疗，但有关降钙素防治此类患者全髋置换术后假体松动的研究报道较少。如何在治疗原发病的同时，又能防止假体的无菌性松动发生，是值得探索的课题。本笔者观察了鲑鱼降钙素对骨质疏松兔假体无菌性松动的影响。
1 材料与方法
11 骨质疏松症动物模型的建立
选用成年健康的雌性新西兰大白兔30只（华中科技大学同济医学院动物中心提供），平均年龄为5个月，体重平均30 kg。采用去势方法来建立模型，即以02～03 ml／kg速眠灵（长春市军需大学兽医研究所）肌注麻醉，在无菌条件下由正中切开腹腔，切除双侧卵巢。给以低钙饮食。采用DEXA骨密度仪（Norland XR36）检测L2~4，去势前为（23265±613）mg／cm2，去势后3个月为（18775±452）mg／cm2，经t检验有明显差异（P＜001），骨质疏松模型建立。
12 聚乙烯磨损颗粒的制备
根据Tipper等〔1〕方法，从因无菌性人工髋关节松动而需要行翻修手术的患者假体周围组织中提取超高分子聚乙烯磨损颗粒（UHMWPE）。
13 人工假体植入动物模型建立
骨质疏松症模型建立后，所有兔均行右侧股骨中段截骨置入假体。行速眠灵肌注麻醉后，在无菌条件下取右侧大腿外侧切口，暴露股骨干，在股骨中上段截骨05 cm，扩髓，植入纺缍型不锈钢假体，并用PMMA与UHMWPE的比例为2×108 μm3颗粒/g〔1〕均匀混合形成含磨损微粒的骨水泥固定假体。
14 处理方法
动物模型建立后，随机分为2组，一组作为实验组，另一组作为对照组，每组各为15只。实验组进行药物治疗，即给鲑鱼降钙素（又名：密盖息，瑞士诺华医药公司生产，批号：S3600），6 U／kg，肌注，隔日1次。同时给以高钙食物（华中科技大学同济医学院动物中心提供）。对照组以同样时间给予等量的生理盐水肌注和同样的食物，共6个月。
15 观察指标
151 假体周围感应区（ROI）骨密度检测
分别于术前、术后4、8、12和24周用DEXA骨密度仪（Norland XR36）检测假体四周感应区（ROI）骨密度（BMD）的变化。
152 骨代谢指标检测
反映成骨细胞活性的骨特异性碱性磷酸酶（BALP）和直接反映成骨细胞的功能状况的血清骨钙素（BGP）；反映骨吸收指标特别反映破骨细胞活性的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP5b）。均采用酶联免疫法（ELISA法）检测。试剂盒均由武汉博士得生物公司生产。分别于术前和术后4、12、24周进行检测。
153 生物力学检测
所有动物于术后24周处死，取出含有假体的右侧股骨，剥离骨上软组织，用日本津岛DSC25T力学万能试验机（华中科技大学机械系实验室提供）检测假体近端拔出试验（拔出强度=拔出力／股骨中段横截面积）和远端的扭转试验（用力矩表示，力矩=扭转力×力臂，力臂均为2 cm）。拔出力和扭转力均为引起假体和骨组织分离的最大力，用牛顿表示。
154 骨组织形态计量学分析
所有动物均于处死前第10 d和第3 d，以25 mg／kg四环素（上海华美生物公司）耳缘静脉注射。处死后取右侧股骨假体周围1 cm处骨组织，去除附着的软组织，立即放入Millonigs液中固定24 h。乙醇逐级脱水，每次24 h，最后二甲苯透明4 h，甲基丙烯酸甲酯包埋。固化后用硬组织刀片机（德国LeicaSP1600）分别切薄片（5 μm）和厚片（10 μm）。厚片用中性树胶封片直接在荧光显微镜下行荧光观察。薄片用乙二醇乙醚乙酸酯脱塑，2％甲苯胺蓝染色，用HPIAS1000图像分析系统（上海九骨科实验室提供）行形态学测量及：代表骨量及细微结构静态指标：骨体积（BV／TV％）、骨小梁面积百分比（％TbAr）、骨小梁厚度（TbTh）、骨小梁数目（TbN）、骨小梁间隙（TbSp）；代表骨形成指标：荧光标记周长百分比（％LPm）、类骨质表面积（OS／BS）、骨矿化沉积率MAR、骨组织形成率（BFR／TV）：代表骨吸收指标：单位骨小梁周长的破骨细胞数目（OcNo／TbPm），侵蚀表面积（ES／BS）。
16 统计分析
采用SPSS／PC统计软件，组间均数比较用t检验，治疗前后均数比较用配对t检验，率比较用卡方检验。
2 结 果
21 假体四周ROI骨密度检测结果
如表1所示，假体四周感应区BMD的改变中实验组提高近5％，而对照组下降了6％，2组间有显著性差异（P＜001）。且实验组中BMD在早中期变化比较明显，后期变化较少（P＞005）。
22 骨代谢指标检测结果
如表2所示，反映骨形成指标BGP和BALP中，实验组显示稍微下降但均无统计学意义（P＞005），而对照组仍在升高，两者比较有显著性差异（P＜005）。反映骨吸收指标的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP5b）中，实验组明显低于对照组（P＜001）。表1 假本四周ROI骨密度结果
23 生物力学检测结果
在拔出实验，实验组是对照组的15倍；扭转实验中，实验组是对照组近2倍。均有显著性差异（P＜001）。（表3）。表3 兔人工假体生物力学测试结果 实验组与对照组比较，反应骨质丢失及骨微结构的%TbAr,TbN增多，TbSp变窄；骨形成与骨矿化指标OS/BS、MAR、BFR/TV及%LPm均增多；骨吸收指标ES/BS、OcNo/TbPm明显减少。多项指标有显著性差异（表4）。
3 讨 论
降钙素是钙磷代谢的重要调控激素之一，是强有力的破骨细胞抑制剂，可直接、快速而广泛地抑制骨吸收，临床上被广泛用于骨质疏松症、畸形骨炎、高血钙症、原发性甲状旁腺功能亢进症等疾病〔2〕。
引起老年骨质疏松患者人工关节无菌性松动的主要3个原因是：（1）磨损微粒作用；（2）应力遮挡或局限性应力集中；（3）本身骨质疏松病理进一步或加重。这些主要原因的细胞生物学基础都表现为破骨细胞的数量的增多和活性增强，促使假体四周骨吸收加剧，最终导致假体周围骨丢失和骨溶解，使假体的支撑结构遭到破坏，从而导致假体的松动。表4 骨形态计量学检测结果 降钙素以抑制破骨细胞来防治骨质疏松患者的骨丢失，它对骨质疏松兔的假体四周的骨质有何影响呢?本实验显示鲑鱼降钙素对假体四周的骨质的作用表现在以下几个方面：
31 降钙素对假体周围骨吸收的抑制作用
由本实验所知：实验组假体周围ROI骨密度明显增加，这表明假体周围的骨量无丢失反而增加；反映破骨细胞功能的骨吸收代谢指标TRAP5b明显下降（P＜001），且假体四周的骨小梁中OcNo数量及陷窝计数明显下降，破骨细胞的活性降低（ES／BS减少）并还可见到实验组的破骨细胞的细胞核数减少骨陷窝变浅而对照组中细胞核大、多，陷窝深（图1、2）。这些表明降钙素对假体周围聚乙烯微粒激活的破骨细胞和应力遮挡以及骨质疏松状态下的破骨细胞同样有强的抑制作用。其可能通过破骨细胞上的降钙素受体直接影响破骨细胞分化成熟、增殖〔3〕，或降低吸收活性、改变细胞功能形态（刷状缘减少或消失）〔4、5〕来抑制假体四周骨吸收;还可以间接作用于单核细胞，抑制其向破骨细胞的转化〔6〕，减少破骨细胞的数量来实现降钙素对假体四周骨吸收的抑制作用。
32 降钙素对假体周围骨形成的促进作用
近年来，有人报告将降钙素用于治疗骨折，减轻骨折固定所致的废用性骨质疏松症，促进骨痂的生长，加速骨折愈合等〔7、8〕；还有研究指出降钙素可直接作用于人成骨细胞，刺激成骨细胞增殖和分化〔9、11〕，并促进形成类骨质，增加矿化〔12、13〕；另有研究指出降钙素有直接促骨形成的作用〔14〕；临床研究中，降钙素能显著提高患者骨密度并长期维持〔15〕，所有这些证实降钙素在抑制骨吸收的同时又刺激骨形成，使骨吸收与骨形成的不平衡得到改善，因而维持或增加骨量。本组实验结果所示：实验组中反映成骨活性的代谢指标：BALP和BGP变化较对照组有显著意义，这表明成骨细胞的活性增强。实验组假体周围骨量明显增多、局部感应区BMD升高（增加5%），且假体周围骨形成指标：荧光标记周长百分比（％LPm）、类骨质表面积（OS／BS）、骨矿化沉积率MAR、骨组织形成率（BFR／TV）均明显增高（P＜001或＜005），表明类骨质数量（图3）及体积增多，矿化率升高。这些均证实降钙素对增加人工假体四周的骨量的促进作用，促进假体四周骨形成、增加骨量。这种骨量增加可能是降钙素对直接作用于假体周围的成骨细胞，刺激成骨细胞增殖和分化、阻止骨细胞和成骨细胞的凋亡〔16〕，增强成骨细胞功能活性，使类骨质增多，骨矿化沉积率增加。
33 降钙素对假体周围骨质量的改善作用
降钙素对假体周围骨量的增加仅为5％而对生物力学的作用提高到150%～200％，这说明它不但可以提高骨量，更能提高骨质量（即骨微结构、骨矿化率等），从而使假体四周骨质的生物力学性能得到明显改善。本组实验的组织形态学也支持这点：骨小梁增多，排列整齐，很少见到微骨折端，而对照组骨小梁稀疏，排列紊乱（图4、5）；正如多数学者〔12、17、18、19〕所认为降钙素能明显提高骨质量、骨强度，这比BMD上升的更明显，且能有效地降低骨质疏松性骨折的发生率。所以，作者认为降钙素能改善假体周围骨微结构，提高假体四周的生物力学性能，有利于防止假体无菌性松动。 图1实验组中破骨细胞数量少，胞核小、少，骨陷窝浅 （×200） 图2对照组中破骨细胞核较多、大，骨陷窝深 （×200） 图3所示为实验组骨小梁类骨质形成活跃 （×100） 图4对照组中，骨小梁稀疏、间隙增大，有断裂骨小梁 （×40） 图5实验组中，骨小梁丰富、粗大、排列较整齐 （×40） 综上所述，本实验表明：鲑鱼降钙素（密盖息）能减少假体周围骨量的丢失和抑制骨溶解，促进骨矿化，提高骨密度，加快假体周围的骨形成，促进骨微结构改变；改善骨质量、增加骨强度，提高骨的生物力学特性和提高假体四周的支撑力。对骨质疏松症兔假体无菌性松动有很好的预防和治疗作用。这将为临床防治老年患者人工关节无菌性松动提供一条新的思路。
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