动静力失衡性大鼠颈椎间盘组织形态学及超微结构
作者：李晨光，王拥军，施杞，胡志俊，周泉，刘梅，周重建
【关键词】 动静力失衡
摘 要：［目的］动态观察大鼠颈部动、静力失去平衡后颈椎间盘组织形态学及超微结构的改变。［方法］SD大鼠60只，随机分为3、5、7个月模型组和对照假手术组，每组10只，通过破坏大鼠颈部肌肉、韧带诱导颈椎间盘退变，按月取材。各组椎间盘HE、Toluidine blue染色，在光镜下观察用体视学分析软件、Dissector自动计数法分析软骨终板内血管芽的数量、面积和软骨终板的厚度，Miyamoto分级法综合评判颈椎间盘退变的程度；透射电镜观察椎间盘细胞凋亡的超微结构。［结果］与对照假手术组比较，3个月造模组动物颈椎间盘已开始退行性变化，纤维环板层结构紊乱，关节软骨钙化层增厚，软骨下血管明显减少；5个月模型组髓核完全纤维化，纤维环板层状结构消失，血管芽稀少，血管壁充血曲张；7个月模型组椎间盘内部结构与5个月模型组相似，部分椎体边缘骨赘形成。在电镜下，3个月造模组椎间盘细胞，细胞表面突起减少，细胞器稀少，胞质内有脂滴，可见到凋亡细胞形成的凋亡小体。5个月和7个月模型组椎间盘组织中细胞较少，基质中胶原纤维断裂，可见到许多坏死空化的细胞。［结论］模型组大鼠颈椎间盘都出现典型的退变形态学变化，随着造模月份的延长退变程度越严重；早期和中期退变椎间盘中可观察到凋亡细胞，在退变的晚期可观察到坏死细胞。
关键词：动静力失衡； 椎间盘； 形态学； 超微结构； 动物模型
Abstract：［Objective］To observe the histomorphology and ultrastructure of the intervertebral disc ( I D ) in the rat model with cervical vertebral unbalance of dynamic and static force［Method］Sixty SD rates were randomly divided into 4 groups: 3 months,5 months,7 months and the control groupThe cervical I D degeneration model was made by destroying the neck muscle of rats and the tissues wer collected every monthThe number,area and thickness of the cartilage endplate were measured by the means of Miyamoto's ClassesThe ultrastructure of the apoptosis cells of the intervertebral disc was observed under the electron microscope［Result］Compared with the control group,the 3 months group showed degeneratin changes,with disordered structure of the annular fibrosis and thickness increase of calcification layer and decrease of blood vessel unmber in the cartilage layerComplete fibrosis was found in nucleus pulposus in 5 months model group,with the fibro lamellar structure disappeared and few blood vessel budsThe features of 7 months model group was similar to 5 months and osteophyma had been formed near the bordr of part intervertebalUnder the electron microscope,the number of surface projection and organelles was decreasedFatty drop and apoptotic body could be seen in disc cells of 3 month model groupFew cells,broken collagen fibers in ECM and more cavitation cells for necrosis in 5 months and 7months model groups could be seen［Conclusion］The cervical I D of model groups has shown typical morphological changes of degeneration and this trend was more serious with the time passingIn the early and middle stage of degeneration,the apoptosis cells can be seen,but in the terminal stage the cellular necrosis was more common
Key words：Unbalance; Intervertebral disc; Histomorphology; Ultrastructure; Animal model
1 材料与方法
11 实验动物
选择3个月龄SPF级SD大鼠，雄性60只，体重（300±20）g左右。随机分为3、5、7个月模型组和对照假手术组，每组10只。由上海中医药大学动物中心提供，合格证号：“SYXK（沪）2004~2005”：动物实验环境等级：SPF级。
12 造模方法〔1、2〕
取大鼠颈背部正中纵向切口，长约20～25 cm，切开皮肤后，充分游离各层肌肉，横向切断深层颈夹肌和头、颈、寰最长肌，完全切除颈髂肋肌和头半脊肌，然后再依次切断C2~7棘上和棘间韧带。假手术组仅切开皮肤后缝合。
13 取材方法
腹腔注射过量麻醉处死大鼠，取颈部椎间盘，在4倍手术显微镜下沿上、下软骨终板与椎体的交界面切下椎间盘。
14 椎间盘组织染色方法
椎间盘取材后，每组10个标本，多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡机包埋，正中额状面连续6 μm切片。染色程序如下。
141 HE染色
常规脱腊至水→自来水冲洗5 min→苏木素染液2 min→自来水冲洗→盐酸乙醇分化→氨水蓝化→伊红染液 1 min→乙醇分化→二甲苯透明→中性树胶封固。
142 Toludine blue染色
常规脱蜡至水→滴加1％甲苯胺蓝液染色6 min→蒸馏水洗→95％乙醇急速分化→无水乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封固。
15 电镜观察
3、5、7个月模型组和对照假手术组，按月取材后，将每组标本取C5、6间盘戊二醛固定24 h，EDTA脱钙2周，刀片正中矢状面剖开，二甲砷酸缓冲液充分洗涤，1％的锇酸溶液作后固定2 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂浸泡包埋，超薄切片机切片，厚500～600 ，枸椽酸铅～枸椽酸铀双染色，透射电镜观察并拍照。
16 数据采集和测量
光镜下对颈椎间盘组织形态学观察，每个标本取2张连续切片观察，按Miyamoto等的分级标准对椎间盘评分（表1）。表1 Miyamoto评分标准
161 软骨终板血管芽数量、面积测量
Disector自动计数法和体视学分析法。各组取6个标本，各个标本连续6 μm切片2张，显微镜下采集图像，尺寸定标，形成图形数据，输入切片间距，医学图像分析软件自动分析。
162 软骨终板钙化层，非钙化层厚度测量
体视学分析法。采用组织病切片，以潮标为分界线，40倍显微镜下，测定每组6个椎间盘软骨终板正中额状面前侧1／3、中心点、后侧1／3钙化层和非钙化层的厚度，取3处测量的平均值。
17 统计分析
SPSS 110软件包，One Way ANOVA统计，平均数±标准差（x-±s）表示。
2 结 果
21 光镜下椎间盘组织形态学观察结果
211 正常颈椎间盘结构的大致形态学描述
采用HE和Toluidine blue染色，在光镜×10~20倍下，可见到椎间盘额状面呈椭圆形，中心是髓核区，胶原纤维排列呈网状，髓核细胞较小，呈圆形，散在其中；外周环绕的是纤维环区，大量胶原纤维排列如同心圆状，纤维环细胞为长梭形状，核呈长柱状，染色深；上下紧邻椎体的是软骨终板，HE染色可见到一条波浪形的潮线，是钙化层和非钙化层的标志线，即潮标（tidemark）。软骨细胞较大，比髓核细胞大2~3倍，3、5成簇的散在于卵圆形的纤维软骨陷窝囊中，核呈圆形，Toluidine blue染色呈深蓝色（图1~5）。
212 假手术组
3、5个月假手术组动物颈椎间盘基本显示正常结构，外周由规则排列的纤维环和中央大的髓核组成；软骨板分为生长软骨层和关节软骨层；关节软骨层由一薄层透明软骨组成，与继发性骨化中心相连接的透明软骨钙化，潮标清晰可见，钙化的关节软骨极薄，钙化软骨与骨髓腔直接接触或与一薄层骨板相邻，钙化的软骨下分布有大量粗大血管（图1）。
213 造模组
3个月造模组动物颈椎间盘已开始退行性变化，纤维环板层结构紊乱，排列轻度不规则，部分髓核组织皱缩；关节软骨钙化层及非钙化层均增厚，潮标前移，关节软骨钙化厚度相当，软骨下骨板增厚，血管明显减少；7个月假手术组也有类似表现；5个月模型组髓核完全纤维化，纤维环板层状结构消失，多数椎间盘突出，部分软骨终板凸向椎体内，血管芽稀少，周边不规则，血管壁充血曲张，部分管壁破裂；7个月模型组椎间盘内部结构与5个月模型组相似，部分椎体边缘骨赘形成，周围包裹有肉芽组织，内有微小血管生长，其细胞成分为肥大的软骨细胞，由软骨终板延伸增殖而来（图2~4、6）。
22 大鼠颈椎间盘退变程度分级
大鼠C6、7软骨终板交界面血管芽数量（个）和面积（×103 μm2），终板钙化层、非钙化层厚度（×10 μm）测量与比较（表2）。 表2中结果说明与对照的假手术组相比，模型组的形态学分值增高（P＜001）；血管芽数5、7个月模型组与3、5个月假手术组比较有降低（P＜001）；而血管面积除3个月模型组外，5、7个月模型与3、5个月假手术组比较有增加（P＜001）;各组间软骨终板的厚度差异不明显，与对照的假手术组相比，模型组钙化层厚度明显增加（P＜001）。说明模型组形态学发生了退变，并随着造模月份的增加，趋势更加明显，在退变的晚期，血管芽不断减少，而面积却在增大。
23 电镜下椎间盘细胞凋亡超微结构的观察
231 正常椎间盘细胞超微结构的大致形态学描述
椎间盘基质中含有许多细丝状的胶原纤维，在细胞周围逐渐形成陷窝；成熟的椎间盘细胞个体较大呈长梭状，大约是红细胞的3～4倍，细胞表面有大量的突起和折迭，胞质中细胞器，线粒体和尼氏体丰富，可见溶酶体内有嗜锇而深染，双层核膜结构完整，核内染色质分布均匀，核仁清晰（图7）。
232 假手术组
3、5个月假手术组细胞超微结构基本正常，基质中胶原纤维排列整齐，细胞膜表面突起丰富，胞内细胞器形态正常，尼氏体丰富，细胞核大而圆，核仁清晰，染色体均匀分布于核中央。
233 模型组
3个月造模组椎间盘细胞，排列紊乱呈水草状，细胞表面突起较少，细胞呈椭圆形，细胞器稀少，胞质内有脂滴，核膜不完整，可见到凋亡细胞形成的凋亡小体：核膜有部分断裂，染色质凝集，内贴核膜，呈同心圆或半月形状，见不到核仁。7个月假手术组也有类似表现；5个月和7个月模型组椎间盘组织中细胞较少，基质中胶原纤维断裂，可见到许多坏死空化的细胞：胞膜胞质中细胞器呈低密度的空泡，核碎裂、溶解，凋亡细胞胞浆内充满嗜锇小体，核膜断裂，异染色质浓聚，边集（图8~10）。表2 椎间盘形态学观察
3 讨 论
颈椎病是因颈部椎间盘、骨、关节及韧带退行性变或因劳损诱发加重退变，导致肌肉、韧带、神经、脊髓、血管遭受到刺激或损害而产生的一系列临床症状和体征的综合征〔1〕。颈椎病临床疗效的提高有待于对其发病机理的进一步研究，建立一种理想的颈椎病动物模型是关键。本实验在了近年颈椎病动物模型的实验研究的基础上，采用王拥军等〔1〕建立的动、静力失衡性颈椎病动物模型，该模型有以下特点：（1）符合颈椎病生物力学原理，骨骼和韧带维持关节稳定和平衡的作用为静力平衡，肌肉维护关节稳定和平衡的作用为动力平衡。颈部正常的生理运动和稳定性是在静力平衡的基础上，依靠肌肉运动来达到动力平衡完成的。（2）符合颈椎病流行病学调查病因：这种造模方式，不伤及椎间盘，由于破坏了动物颈后部软组织结构，使动物有低头倾向，逐渐造成颈椎间盘退变。与造成人低头劳损的颈椎病成因相似。（3）模型成本节约、易操作性强、可量化、成功率高：本实验使用的是SD大鼠，熟练操作10 min就可完成模型制作，术后通过3、5、7个月不同时间段来量化退变的程度，除了麻醉意外，模型手术基本都可成功。
正常椎间盘是一个无血管的组织，营养供应主要是通过2个途径被动扩散而来，一是终板途径，即椎体内血管的营养物质通过骨髓腔血窦-软骨终板界面扩散到椎间盘，营养髓核与纤维环内层；二是纤维环途径，即纤维环表面血管营养纤维环外层。Ogata等〔3〕用氢清除技术研究狗腰椎间盘，证实软骨终板渗透是椎间盘主要的营养途径。Nerlich等〔4〕认为椎间盘营养供应主要通过椎体-软骨终板-椎间盘界面的通透作用，软骨终板钙化、椎体-软骨终板界面血管芽的萎缩将直接影响椎间盘的营养供应。本实验结果表明，与对照假手术组比较模型组大鼠椎间盘血管芽数随着月份的增加有减少的趋势。血管面积除3个月模型组外，5、7个月模型与3、5个月假手术组比较有增加（P＜001）。说明在退变的晚期，血管芽不断减少，而面积却在增大。对照光镜下观察可发现正常椎间盘的血管芽由椎体骨髓腔血窦发出伸入软骨终板内，断面呈规则的类椭圆形。退变椎间盘的血管芽数量减少，分布不均，形状不规则，尤其在退变的晚期，血管壁粗糙不平，充血曲张，部分管壁破裂。认为：血管芽的数量减少是椎间盘血供量下降的表征，血管因充血曲张而面积增大，以上2方面的原因导致血瘀的发生。软骨终板厚度的测量结果表明各组间软骨终板的厚度差异不明显，与对照的假手术组相比，模型组钙化层厚度明显增加，并随着月份的增加，这个趋势更剧烈，与对照的假手术组相比，模型组非钙化层厚度明显降低（P＜001），并随着月份的增加，这个趋势更明显。椎间盘退变过程中供应椎间盘周围的动脉数量减少、软骨终板逐渐钙化，这些改变妨碍了营养物质的供应和废物的排除〔5〕。
退变椎间盘的本质是其细胞本身的功能退化、凋亡和坏死。目前国内外研究都证实了椎间盘超微结构的改变与椎间盘退变程度相关：（1）退变椎间盘超微结构的改变影响其营养供应：椎间盘营养供应主要依赖于周围血管通过椎体-软骨终板-椎间盘界面的扩散和渗透。赵为公等〔6〕研究发现颈椎病患者椎间盘细胞软骨囊（陷窝）的电子密度增高，这将使细胞更难接近其所需的营养和酶的作用，形成恶性循环，囊内细胞更易变性坏死；（2）基质中胶原纤维的改变：Cruber等〔7〕电镜下观察不同年龄阶段椎间盘胶原纤维的波纹（crimp）发现，胶原纤维在正常间盘排列紧密，呈波浪状，而在退变间盘中排列稀疏和折皱；（3）细胞器的改变：尼氏体（Nissl body）：大量的密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些多聚核糖体和单个核糖体，是合成蛋白质的主要场所。线粒体：数量多，呈板状或管状嵴，为细胞代谢提供能量。刘勇等〔8〕电镜下观察突出椎间盘组织，发现细胞胞质中的线粒体数量少或看不清，粗面内质网减少，严重退变细胞中溶酶体、空泡和微丝增多，坏死细胞中细胞器空化。这些都是细胞功能衰退的征象，并与退变的程度相关；（4）退变的不同阶段细胞超微形态亦不同：谭炳毅等〔9〕电镜下观察发现：在椎间盘退变较早期，椎间盘细胞形态已有改变，细胞器增多，但有变形，有许多大、小不等的囊泡，可见溶酶体，显示细胞功能较旺盛，但细胞本身也在退变，处于一种自身代偿状态，称该期为颈椎间盘退变的较早期阶段，为功能代偿期或可逆期。在椎间盘退变晚期，椎间盘细胞外形极不规则，细胞器大部消失，在极严重退变的细胞中，整个细胞颜色加重，内部无任何结构，处于临近崩解状态。因细胞功能丧失，其生化成分必将出现严重变化。该期为颈椎间盘退变的晚期阶段，即不可逆期。本实验电镜观察结果与上述报道一致，证实了动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型椎间盘超微结构的改变与椎间盘退变程度相关，伴随着椎间盘的退变，椎间盘细胞的生存环境、数量和质量都发生了改变，而在退变的晚期这种改变是严重和不可逆的。赵为公等〔8〕采用Trout方法对10个铜网内的细胞计数，统计观察结果。谢林等〔10〕采用每个电镜样本下随机观察10个细胞，2个样本共观察20个细胞，来统计细胞的数量和退变情况。以上方法在以后的研究中都是值得借鉴和进一步探讨。Cruber等〔11〕对手术取出的腰椎间盘进行细胞凋亡检测的研究，检测到标本中的细胞凋亡率高达53%~73％。谭炳毅等〔9〕电镜观察到脊髓型颈椎病椎间盘以坏死细胞为主，退变细胞较少。本实验研究结论认为，在椎间盘退变的早期以细胞凋亡为主，晚期以坏死为主。提示椎间盘退变的早期采取干预是的关键。
文献：
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