Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG

               作者：李鲲，杨述华，刘红云，吴强，傅德皓

【关键词】  骨肉瘤

    摘  要：［目的］观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。［方法］体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence 21neoSurvivin，转染骨肉瘤细胞系MG63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RTPCR、Westonblot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。［结果］转染后MG63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为8508％和8114％；细胞增殖受到显著抑制，培养48 h后与空白组比较，抑制率达6341％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为2454％。［结论］靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。

   关键词：Survivin；  siRNA；  短发夹状RNA；  骨肉瘤；  细胞增殖；  细胞凋亡

     Abstract：［Objective］To construct an expression plasmid of a short hairpin RNA targeting Survivin,and investigate its effect on the expression of Survivin,the proliferation and the apoptosis of human osteosarcoma cell line MG63 in vitro［Method］A plasmid of a short hairpin RNA targeting Survivin was constructed,and it was transfered into MG63 cell line by dosper liposomal methodMorphological change of tumor cells was observed under invert microscopeThe expression of Survivin mRNA and protein were examined by RTPCR and Westonblot method respectivelyThe inhibition of the cell proliferation was estimated by MTT method and the colony forming testThe apoptotic cells were stained by acridine orange［Result］The number of drift cells was increased after transfection,Survivin shRNA could significantly reduce the expressions of Survivin mRNA and proteinThe expression of Survivin mRNA and protein after transfection was respectively inhibited by 8508% and 8114%,Survivin shRNA also inhibit the growth of the cell by MTT method and the inhibition rate reached 6341% at 48 h,the apoptosis rate of the cells in the transfected group was 2454%［Conclusion］Survivin shRNA could significantly reduce the expressions of Survivin mRNA and protein and inhibit the proliferation of the MG63 cell,and increase the apoptosis of the cells

   Key words：Survivin;  RNA interference;  Short hairpin RNA;  Osteosarcoma

   Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族新成员。它可以通过抑制凋亡途径中的casepase3和casepase7活性等途径，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤增殖〔1〕。为此，作者设计并构建了靶向Survivin基因的siRNA表达载体，转染人骨肉瘤MG63细胞系，检测其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，为骨肉瘤的基因提供一个新的靶点和方向。

   1  材料与方法

   11  材  料

   人骨肉瘤细胞系MG63为本教研室保存，Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品，pSilence21neo为Ambin公司产品，购自武汉晶赛公司，RTPCR试剂盒为MBI公司产品，鼠抗人Survivin单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，细胞培养的有关试剂均购自Gibico公司。

   12  实验方法

   121  pSilence21neoSurvivin表达载体构建及细胞转染

   参照Harborth等〔2〕的干涉RNA设计原则，以人Survivin的mRNA序列5TTCGTCCGGTTGCGCTTTC3为靶点，体外合成两端带有BamH Ⅰ和HindⅢ粘端酶切位点、内含5TTCGTCCGGTTGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCAACCGGACGAA3发夹状序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence21neo载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分4组进行处理：空白组、脂质体组、空载体组、shRNA组，转染步骤参照脂质体使用说明书进行。空载体组和shRNA组转染后72 h，以G418筛检14 d，挑出阳性克隆，扩大培养。

   122  RTPCR检测细胞Survivin mRNA的表达

   分别收集各组细胞，参照Trizol说明书提取细胞总RNA，并进行逆转反应。引物的序列为：Survivin：上游：5′ATGGGTGCCCCGACG TTG3′下游：5′AGAGGCCTCAATCCATGG3′，扩增产物436 bp。同时以βactin：上游：5′TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3′下游：5′CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3′为反应内参（扩增片段172 bp）。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线下观察并各条带的积分吸光度（IA），以Survivin与βactin的IA比值表示Survivin mRNA的相对含量。

   123  Westernblot法检测Survivin蛋白表达

   收集各组细胞，提取细胞总蛋白，电转移法将蛋白转移至醋酸纤维素滤膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2 h，依次加鼠抗人PCNA单抗及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠多抗，DAB显色。测定每条条带的面积和灰度值，计算积分灰度值以代表蛋白质的表达量。

   124  MTT法检测细胞活性

   将对数期生长的各组细胞，按6×103个／孔分别接种到96孔培养板中，在培养24、48、72、96 h后收集上述4组细胞，MTT法，酶标仪下570 nm波长测OD值，每组3孔，重复3次，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组OD值处理组OD值）／空白组OD值×100％。

   125  吖啶橙染色检测细胞凋亡

   收集处理后各组细胞，经吖啶橙染色，荧光显微镜下观察500个细胞，计算凋亡率：凋亡率=凋亡细胞数／500×100％。

   126  克隆形成试验

   将各组细胞以200个/孔细胞接种于60 mm2培养皿中，静止培养10 d，镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率：克隆形成率=克隆数／200×100%。

   13  统计学处理

   采用SPSS100统计软件，对数据进行t检验。

   2  结  果

   21  倒置显微镜观察转染后形态学改变

   转染组细胞出现明显细胞皱缩、形态变圆、核分裂相减少、漂浮细胞增多等凋亡改变，而空载体组、脂质体转染组和空白组仅有少量细胞出现漂浮，大部分细胞形态基本正常，贴壁生长良好。

   22  Survivin shRNA转染对MG63细胞Survivin mRNA、蛋白表达的影响（表1）

   Survivin RTPCR结果显示：shRNA组Survivin mRNA表达的条带亮度低于其余各组（图1），统计学分析显示：shRNA组mRNA的表达显著低于空白组，余各组之间无明显差别。Westernblot结果显示：转染组Survivin蛋白条带的灰度低于其余各组（图2），统计学分析结果显示：shRNA组蛋白表达显著低于其他组（P＜001）。Survivin shRNA对MG63细胞Survivin mRNA（表2）。表1  蛋白表达及克隆形成的影响

  23  MTT比色法比较细胞增殖活性（表2）表2  MTT法检测Survivin shRNA对MG63细胞增殖的抑制作用

  24  细胞凋亡检测结果

   shRNA组大量细胞出现明显细胞核浓集、碎裂等典型细胞凋亡征象，凋亡阳性细胞荧光显微镜下表现为细胞核呈现黄绿色不均一浓染致密的团块或颗粒（图3）。余组细胞胞核呈均匀染色，少见凋亡细胞（图4）。shRNA组细胞凋亡率（2454％）与余组相比有显著差异（P＜001）。

   25  克隆形成实验（表1）

   空白组、脂质体组、空载体组相比克隆形成率差异无显著性意义，而shRNA组与空白组、脂质体组和空载体组相比克隆形成率明显减低（P＜001），且克隆直径较小，细胞松散。

   3  讨  论

   恶性肿瘤无限增殖的主要原因是细胞凋亡调控障碍。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）成员，具有控制细胞凋亡和调节细胞分裂的功能。Survivin可以通过抑制凋亡通路下游的Caspase3和Caspase7而发挥抗凋亡作用〔1〕。此外，Survivin还特异地在细胞周期G2M期高表达，通过与细胞有丝分裂纺缍体的微管结合，参与细胞增殖的调节〔3〕。与其它IAP家族成员不同，Survivin的组织学分布具有明显的细胞选择性，Survivin表达于未分化成熟的胎儿组织，在高分化的成人组织中不表达（胸腺、生殖腺除外）。但在大多数常见肿瘤组织如：肝癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤都有高表达，且其表达和肿瘤的恶性程度、预后和复发有关〔4、5〕。Olie〔6〕等研究发现，应用Survivin mRNA的反义寡核苷酸，可以抑制肺癌Survivin的表达，促使肿瘤细胞凋亡，同时增加对化疗药物的敏感性。Crrossman〔7〕等人将Survivin反义寡核苷酸注入荷黑色素瘤小鼠体内，发现它可以显著抑制Survivin表达并刺激肿瘤特异性CTL表达，抑制肿瘤生长。

   RNA干扰是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）引起与其同源mRNA的特异性降解，因而抑制其相应基因表达的过程。由于这种技术具有效率高、特异性强、显效快、可以向子代遗传和可同时进行多基因研究等优点，因此很快成为了进行基因研究的热点工具。目前，越来越多的关注集中在利用RNAI研究哺乳动物和人类基因功能，许多研究者发现siRNA在哺乳动物细胞中可以显著抑制内源性基因和外源性基因的表达。Harborth等〔2〕分别用合成的仅21个核苷酸（21nts RNAs）组成小的干涉siRNA分别作用于NumA等16个基因，使培养的哺乳类细胞中这16个基因均明显抑制表达，用相应的抗体在斑点杂交（western blot）或免疫荧光几乎检测不到所表达的蛋白。

   本研究成功构建了Survivin shRNA表达载体pSilence21neoSurvivin，并通过脂质体导入MG63细胞，观测其对细胞Survivin表达及细胞增殖、凋亡的影响。RTPCR及western blot结果显示，Survivin shRNA转染可显著抑制Survivin mRNA及蛋白的表达，证实了应用RNA干扰技术抑制Survivin表达的可行性。吖啶橙染色实验显示Survivin shRNA转染通过抑制Survivin的表达对细胞的凋亡产生显著的促进作用，此外，MTT法及克隆形成试验结果证实Survivin shRNA转染可有效抑制人骨肉瘤细胞的增殖活性。本研究结果为应用shRNA进行骨肉瘤基因的进一步研究提供了实验基础和方向。

 
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   〔1〕  Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al.An antiapoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase3 and7［J］.Biochemistry,2001,40（4）:11171123.

   〔2〕  Harborth J,Elabshir SM,Bechert K,et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs［J］.J Cell Sci,2001,114（24）:45574565.

   〔3〕  Sarela AI,Verbeke CS,Ramsdale J,et al.Expression of survivin,a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein,in pancreatic adenocarcinoma［J］.Br J Cancer,2002,86（6）:886892.

   〔4〕  Altieri DC.The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy［J］.Trends Mol Med,2001,7（12）:542547.

   〔5〕  Trieb K,Lehner R,Stulnig T,et al.Survivin expression in human osteosarcoma is a marker for survival［J］.Eur J Surg Oncol,2003,29（4）:379382.

   〔6〕  Olie RA,SimoesWust AP,Baumann B,et al.A novel anfisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［J］.Cancer Res,2000,60（11）:28052809.

   〔7〕  Grossman D,Kim PJ,Schechner JS,et al.Inhibition melanoma tumor growth in vivo by surviving targeting［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98（2）:635640.