纤维粘连蛋白EDA+片段在退变椎间盘中的表达及其意义

                作者：胡宝山，丁悦，李春海，刘尚礼，吕浩然，叶伟

【关键词】  椎间盘退变

    摘  要：［目的］检测退变椎间盘内EDA+ Fn的表达，探讨损伤在椎间盘退变中的作用。［方法］收集人腰椎间盘退变临床手术标本，经病理证实均发生退变，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术扩增目标条带。［结果］正常椎间盘内没有EDA+ Fn的表达，而退变椎间盘内均有EDA+ Fn的表达；中重度退变者EDA+ Fn的表达较轻度退变者为多（轻中度组间P=0016＜005；轻重度组间P=0007＜005），中重度之间则没有明显差别（P≥0501）。［结论］EDA+ Fn在退变椎间盘内有较高表达，直接证明损伤是椎间盘退变的重要的致病因素之一。

   关键词：椎间盘退变；  纤维粘连蛋白；  可变剪接

   Abstract：［Objective］To study the relationship between trauma and the lumbar disc degeneration and to detect the expression of the fibronectin splicing variants in the degenerated lumbar intervertebral disc,and study the expression of EDA［Method］The human lumbar intervertebral disc tissues were collected to extract total RNA which was then amplified by RTPCR technique［Result］EDA+ Fn of normal lumbar intervertebral disc were not expressed,whereas EDA+ Fn of degenerated lumbar intervertebral disc were expressed abundantlyThe defference between different groups has statistical significance［Conclusion］EDA+ Fn has very strongly expression in the lumbar degenerated intervertebral disc,and the trauma is one of prerequisite factors in the disc degenerated process probablely

   Key words：Intervertebral disc degeneration;  Fibronectin;  Alternative splicing

   下腰痛是脊柱外科的常见病，其中椎间盘退变为其主要原因之一，椎间盘退变的病因包括年龄、创伤、遗传等因素。但究竟何种机理启动退变，目前尚不清楚。椎间盘退变机理的研究是目前国内外脊柱外科研究的热点。纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）是一种大的纤维状糖蛋白，在机体内广泛存在，已证实其可变性剪切异形体EDA+ Fn与损伤关系密切，常常作为损伤鉴定的标志。同时发现EDA+ Fn能够体外诱导某些与椎间盘退变关系密切的细胞因子、相关酶类的表达。本研究检测正常和退变椎间盘组织中EDA+ Fn的表达，探索椎间盘退变的机理。

   1  材料与方法

   11  主要材料与试剂

   退变椎间盘标本取自椎间盘突出症患者手术摘除的标本，共10例，均经病理证实有腰椎间盘退行性变。对照组3例椎间盘组织标本，取自新鲜尸体，经病理检查未见退变表现。取出组织立即液氮冷冻后，放入零下80 ℃保存备用。RNA提取试剂盒（美国MRC公司）；RT试剂（Promega公司）；PCR试剂盒（TaKaRa宝生物工程公司）：引物由上海生工生物工程公司合成，分别为：EDA，5′GAC TAT TGA AGG CTT GCA GCC3′（sense），5′CTT GTG GGT GTG ACC TGA GTG3′（antisense）（扩增长度包含EDA片段495bp，不包含EDA片段356bp）;GAPDH，5′TCT TCT TIT GCG TCG CCA GC3′（sense），5′GAG GCA GGG ATG ATG TTC TG3′（antisense）（扩增长度453 bp）。

   12  MRI确定椎间盘退变与否的标准

   取矢状位MRI T2加权图像，重复时间2 500ms，回波时间90 ms。图像由有经验的专业医师行双盲评定。结果按Schneidermans分级，标准为：1级（正常）：正常信号强度；2级（轻度）：椎间盘信号轻度减低；3级（中度）：信号重度减轻；4级（重度）：椎间盘信号完全消失。对照组均为1级，实验组2级4个标本，3级3个标本，4级3个标本。

   13  RTPCR反应

   液氮研磨各组组织标本后，抽提总RNA，进行RTPCR扩增，每管加入待测基因引物进行扩增，EDA扩增PCR反应体系采用94 ℃ 5min、94 ℃ 30s、56 ℃ 30s、72 ℃ 30s进行30个循环，总反应体系50 μl。GAPDH反应条件与EDA相同，反应结束后，取5 μl反应产物加入2 μl 6×上样缓冲液，1 μl金胶体，2％琼脂糖电泳，UVP凝胶成像，利用凝胶分析软件，用待测EDA+基因与内参基因扩增的特异性条带的光密度积分值的比值反应待测基因表达的强弱。标准分子量参照TaKaRa公司100 bp DNA Ladder（长度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000bp）。

   14  统计学处理

   实验数据均以均数±标准差（x-±s）表示，采用方差分析，监测各组之间mRNA的表达有无统计学意义。

   2  结  果

   正常和退变椎间盘标本均扩增出EDA+片段（356 bp）高亮度条带，其中正常椎间盘组（n=3）均没有EDA+ 片段（495 bp）表达（图1）。退变组均有EDA+ 片段的表达，以内参为标准（图2），进行半定量分析发现，EDA+ 片段表达与椎间盘退变的程度关系密切，中重度退变者EDA+ Fn的表达较轻度退变者为多（轻中度组间F=12769，P=0016＜005；轻重度组间F=19820，P=0007＜005），中重度之间则没有明显差别（F=0545，P=0501＞005）。 图1EDA片段mRNA在退变椎间盘中的表达  〔注：从左至右M：DNA marker;Nor:正常组；D1：轻度退变组；D2：中度退变组；D3：重建退变组。扩增片段：EDA+片段（495 bp上方条带）；EDA+片段（356 bp下方条带）；marker为100~1 000bp〕  图2各标本的GAPDH内参条带（453 bp）

　　3  讨  论

   下腰痛是脊柱外科的常见病和多发病。是导致成人丧失劳动能力的主要疾病之一〔1〕。下腰痛的主要原因为椎间盘退变，对于椎间盘退变患者，目前临床上多先采用保守，症状不能缓解的患者，采用手术治疗，远期优良率在70％左右，疗效并不理想〔2〕。因为减压和融合的治疗方法不能恢复和保持椎间关节的正常结构与生理功能，不能减缓椎间盘退变的进程，从而有效治疗椎间盘退变需要新的治疗方法，鉴于此，揭示腰椎间盘退变的原因和机理显得尤为重要。

   Fn是一种大的纤维状糖蛋白，它具有同时与细胞周基质中多种成分相结合的功能，所以又被称为“中心因子”。EDA基因片段是Fn基因上的可变性剪接片段，在正常组织中除脑、肝、肺的Fn外极少有EDA片段的表达，在损伤组织中，EDA可有高表达，因此推测损伤过程中Fn对炎症细胞的趋化作用，对成纤维细胞的诱导分化，均与EDA的表达有关〔3〕。在法医学损伤时间推断的研究中，EDA作为一种比较理想的指标越来越受到重视。在风湿性关节炎患者的关节液中EDA+ Fn明显增高，且与患者关节毁损程度呈正相关，即EDA+ Fn浓度高的关节毁损率较高。在体内发现一种160 Kda的EDA+ Fn能诱导MMP1的表达，同时体外实验发现EDA+ 的Fn片段能够上调IL1的表达，促进MMPs的表达，降解蛋白产物，诱导Ⅰ型胶原的表达〔1〕。

   目前所知的腰椎间盘退变过程为某种始发因素启动细胞或基质内炎症介质的产生、蛋白酶类的激活、结果导致Ⅰ型胶原增多，Ⅱ型胶原降解，浓度降低，Ⅰ、Ⅱ型胶原比例失调，最终产生临床相应表现〔5〕，与EDA+ Fn在机体损伤组织修复的过程中所表现出的变化基本相同。已有研究表明组织损伤后Fn基因表达发生变化，EDA+ Fn大量表达，诱导炎症介质的产生，启动细胞膜和细胞中各种信号传导酶类的激活，成纤维细胞的增殖，Ⅰ型胶原的增多，进而以瘢痕组织初步完成损伤组织的修复。因此推测腰椎间盘退变过程中，损伤是必不可少的条件，虽然Ⅰ型胶原的增多，瘢痕组织的形成是组织修补的正常过程，但因为椎间盘组织的特殊性，导致这种正常的修复过程变成一种病理过程，从而促进椎间盘退变。但对于EDA+ Fn在退变椎间盘中是否有所表达、表达程度如何，EDA+ Fn在椎间盘内是否能够导致Ⅱ型胶原的减少、Ⅰ型胶原的大量增生仍不清楚。本文首次探讨了退变椎间盘内的EDA+ Fn的表达情况。结果表明，正常椎间盘内未见EDA+ Fn的表达，所有退变椎间盘内均见EDA+ Fn的表达，而且根据MRl分级对电泳结果进行半定量分析发现中重度退变者EDA+ Fn的表达较轻度退变者为多，中重度之间则没有上接372页）

   明显差别。结合EDA+ Fn的与组织损伤的相关性，这一结果说明损伤为椎间盘退变发生的重要致病因素。其他致病因素可能为椎间盘损伤提供了倾向性，例如遗传因素、年龄因素等均使椎间盘更容易受到“伤害”。在损伤后，椎间盘内启动组织修复机理，即炎症介质和蛋白酶类被激活、成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原增多、Ⅰ、Ⅱ型胶原比例失调等，使椎间盘生物力学发生变化，导致纤维环结构的破坏和髓核脱水。

   本实验直接证明了椎间盘退变可能和损伤因素有着更为紧密的联系，对以往流行病学调查结果表明的职业因素和创伤是其致病因素的直接证明〔6〕。椎间盘退变过程中，损伤可能是必不可少的条件，其他致病因素均为辅助因素。对于EDA+ Fn在椎间盘内具体作用还不清楚，是否能够导致炎症介质的产生，相关酶类的变化，胶原比例失调还不可知，相关研究正在进行之中。

   ：

   〔1〕  Hashemi L,Webster BS,Clancy EA.Trends in disability duration and cost of workers compensation low back pain claims（1988~1996）［J］.J Occup Environ Med,1998,40（12）:11101119.

   〔2〕  Yorimitsu E,Chiba K,Toyama Y,et al.Longterm outcomes of standard discetomy for lumbar disc herniation:a followup study of more than 10 years［J］.Spine,2001,26（6）:652657.

   〔3〕  Saito S,Yamaji N,Yasunaga K,et al.The fibronectin extra domain a activates matrix metaloproteinase gene expression by an interleukinⅠdependent mechanism［J］.J Biol Chem,1999,274（43）:3075630763.

   〔4〕  Serini G,BochatonPiallat ML,Roptaz P,et al.The fibronectin domain EDA is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factorβⅠ［J］.J Cell Biol,1998,14（2）:873881.

   〔5〕  黄宗强，刘尚礼，郑召民.椎间盘退变的分子生物学研究进展［J］.矫形外科杂志，2003，11（1）：5556.

   〔6〕  赵序利，于锡欣.椎间盘退变的病因研究［J］.中国矫形外科杂志，2002，9（3）：273274.