新型骨替代材料-珍珠层的生物相容性研究

           作者：吴一民，陈建庭，金大地 

【关键词】  骨替代材料

    摘  要：［目的］研究珍珠层的生物相容性。［方法］在体外培养的第3代成骨细胞中分别加入珍珠层（实验组）、橡胶（对照组）的材料浸提液，观察细胞形态、细胞膜和超微结构的变化；通过BrdU核掺入法检测细胞增殖情况、通过MTT法检测成骨细胞代谢活性。［结果］实验组细胞形态及细胞结构良好、细胞膜完整；对照组中细胞形态发生改变，细胞膜及胞浆内细胞器均有破坏；BrdU及MTT检测结果显示珍珠层对人成骨细胞的增殖和代谢活性无阻滞作用。［结论］珍珠层具有良好的生物相容性，可作为骨替代材料应用于骨缺损修复。

   关键词：骨替代材料；  珍珠层；  成骨细胞；  生物相容性

      Abstract：［Objective］To study the biocompatibility of nacre on cultured human osteoblasts in vitro［Method］The iliac bone of human were added with collagenasetrypsin,a lot of osteoblasts were released outThen the osteoblasts were purified and culturedSubsequently,the 3rd generation cultured human osteoblasts were inoculated with the extract of three materials:nacre,hydroxyapatite,and rubberThe appearance of osteoblast was observed under the phase contrast microscopeMicrostructure of the osteoblast was observed under transmission electron microscopeAdditionally,to determine whether these three materials affect cell proliferation,the numbers of BrdUlabeled cells were examined at three groupsMTT assay was tested to observe the viability of human osteoblasts［Result］Under the phase contrast microscope,the appearance of the osteoblasts in two groups were spindle or triangle like,and black nodes were seen in confluent cell layer 19 days after culturedThe observation of electron microscopy showed that the nucleus of the osteoblasts in two groups were big and round,and there were a large number of mitochondrion and rough endoplasmic reticulum in two groupsStereological analyses of the numbers of BrdUlabeled cells revealed that females produced more cells than males in the dentate gyrus but not in the subventricular zone［Conclusion］The nacre have no harmful effect to character of biology of human osteoblasts in vitro

   Key words：Bone substitution material;  Nacre;  Osteoblast;  Biocompatibility

   珍珠层是海洋生物珍珠贝科动物珠母贝的贝壳内层，通过生物的自我矿化而形成。近年来，国外学者的研究证实珍珠层是一种具有广阔的科研价值和临床应用前景的骨替代材料〔1〕。国内在这方面的研究多为基于中医理论的描述，观察珍珠层粉的生肌、收敛等作用，将珍珠层作为骨替代材料的研究未见报道。本实验采用作者自行研制的珍珠层材料，研究该材料的生物相容性，为其临床应用提供依据。

   1  材料与方法

   11  材  料

   珍珠层：将马氏珠母贝（中科院南海海洋研究所提供）在去离子水中浸泡48 h后，机械磨除其外层，蒸气熏蒸4 h后真空干燥，制成粉剂。丁睛橡胶粉末:市售。

   12  材料浸提液

   将珍珠层、天然橡胶分别与09％生理盐水按比例（02 g／ml）在37 ℃下浸提12 h制成浸提液，消毒备用。

   13  人成骨细胞分离培养和鉴定〔2〕

   14  实验分组

   实验分为：A珍珠层组（试验组）、B橡胶组（对照组），每组包括加盖玻片24孔培养板2块，100 ml培养瓶1只，96孔培养板4块。将第3代成骨细胞分别接种于两组细胞培养板及培养瓶中，细胞密度为2×105个／ml，加足培养液后密闭培养。次日在倒置相差显微镜下观察细胞已贴壁后,倒出原培养液，按1∶1的比例加入培养液和材料浸提液，密闭培养并作各种指标的测定。

   15  检测项目及方法

   151  细胞形态观察

   通过Olympus倒置显微镜动态观察体外培养的人成骨细胞加入两种材料浸提液后细胞形态及生长情况的变化。

   152  细胞超微结构观察

   通过透射电镜观察试验组与对照组细胞超微结构的变化。培养48 h后，用细胞刮器将成骨细胞由培养瓶中刮下，离心后，加入2％戊二醛固定24 h，PBS充分漂洗，1％四氧化锇后固定15 h，梯度丙酮脱水（50％、70％、90％、100％3次，每次15 min），环氧树脂浸透包埋，超薄切片机进行自动半薄切片，铀-铅染色，EM1200EX型透射显微镜观察。

   153  细胞膜完整性测定

   采用AOEB混合染色法检测两种材料浸提液对细胞膜的影响。将吖啶橙用磷酸盐缓冲液配成浓度为20 mg/L液体，溴化乙锭配成浓度为5 mg/L液体，取等量配成AOEB混合液备用。培养24 h后，将6孔培养板中的盖玻片取出，PBS冲洗2次，滴加AOEB混合染液，染色2 min，磷酸盐缓冲液冲洗，荧光显微镜下检测。

   154  细胞增殖能力测定

   采用5溴脱氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine BrdU）核掺入法检测细胞DNA合成。将第3代人成骨细胞同步化后，实验组加入珍珠层浸提液，对照组加入橡胶浸提液，分别于培养6、9、12、24h后在待测细胞中加入无菌100 μmol／L BrdU标记液，（20 μl／孔），37 ℃孵育30 min。01％中性福尔马林固定15 min，PBS冲洗，02％Triton X100 5 min，2 mol/L HCl 37 ℃变性40 min，05％BSA／01％Tween孵育20 min，小鼠抗BrdU单克隆抗体37 ℃下作用1 h，生物素化羊抗小鼠IgG室温下作用30 min，滴加SABC室温下作用30 min，DAB显色，光学显微镜观察，每张玻片在10倍物镜下随机选5个视野，Leicaquantimet 500图像分析系统每个视野细胞总数和阳性细胞数，计算标记指数（LI）。LI=（阳性细胞数／细胞总数）×100％。

   16  统计方法

   所测数据采用SPSS 80软件包进行统计学处理，Independent samples T test作均数的显著性检验，P＜005时为有统计学差异。

   2  结  果

   21  细胞形态

   在倒置显微镜下可见实验组细胞贴壁生长。6 h左右，可见细胞呈纺缍形，细胞核居中，胞浆向外伸展，并伸出突起。12 h左右，细胞数量逐渐增多，细胞体积增大。培养的第24 h，可见细胞数量迅速增长，细胞体积增大，呈三角形或多角形等形态，胞浆丰富，且细胞部分相连。48 h左右，相邻细胞彼此贴靠或两者突起相连，细胞边界难以区分，基质中可见较多的基质小泡并出现结节样物，呈立方形。对照组中6 h左右，大多数细胞呈纺缍形贴壁生长，部分细胞呈圆形，细胞中可见细胞核碎裂，核内及胞浆内结构被大量空泡代替，可见少量悬浮死细胞。12 h左右，圆形及悬浮死细胞数量增多。培养的第24 h，可见大量悬浮死细胞。剩余的贴壁细胞呈圆形，细胞间没有连接，胞浆少。48 h左右，视野内充满悬浮死细胞，基本没有贴壁细胞。

   22  细胞超微结构观察

   在透射电镜下，可见实验组成骨细胞细胞核大、呈椭圆形，位于胞体一端，核膜完整，核仁清晰。胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体，并出现高尔基体以及囊泡，在细胞间质中则可见散在的胶原纤维，部分线粒体内可见致密物。对照组细胞核外形不规则、核膜结构不完整，核内及胞浆内有大量空泡，胞浆内细胞器被破坏（图1~2）。

   23  AOEB混合染色法细胞膜完整性测定

   荧光显微镜下可见实验组细胞呈多角形，细胞质和细胞核均呈黄绿色荧光，荧光密度较均匀；对照组细胞呈圆形，细胞核呈橙红色荧光，核偏移，细胞体积缩小，轮廓不清，已解体或临近解体（图3~4）。

   24  细胞增殖能力测定

   光镜下可以观察到BrdU阳性表达位于细胞核，阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色或黄赫色。实验组中BrdU阳性细胞数量随着培养时间的延长而增加，6 h时，可见较多的阳性细胞，9 h到12 h阳性细胞数量显著增加；阳性细胞百分率〔阳性细胞／（阳性细胞+阴性细胞）×100％〕从6 h到9 h呈上升趋势，9 h以后基本不变；对照组在培养6 h后，可见少量Brdu阳性细胞，9 h后阳性细胞数减少，培养12 h后，对照组中已经观察不到阳性细胞。通过对两组中阳性细胞百分率（标记指数）进行统计检验，结果显示珍珠层组与橡胶组比较差异有显著统计学意义（P＜001）（表1）。 表1  实验组和对照组细胞标记指数比较

　　3  讨  论

   研制理想的骨缺损修复材料是矫形外科领域努力探索的课题之一。珍珠层的理化性质及生物学特性与骨组织非常接近，适合作为骨替代材料来修复骨缺损〔3〕，珍珠层含有蛋白多糖等大分子物质和锶、镁等金属元素，这些成分在珍珠层植入体内后对组织和细胞是否有毒、副作用是影响其应用的首要因素，因此，评价珍珠层的生物相容性，对于珍珠层这种新型骨替代材料的研制和临床应用起着重要的作用。近年来，通过体外细胞复合培养法从细胞和分子水平去观察材料对细胞的形态、增殖、分化的影响已成为评价生物相容性所采用的主要方法。骨替代材料用于骨缺损的修复，其生物学功能是为成骨活动提供良好的微环境，成骨活动是一个以成骨细胞为中心的，由支架、破骨细胞及多种生长因子参入并调控的复杂的生理活动。因此，研究人工骨材料对成骨细胞骨形成能力的影响，是评定人工骨材料生物学性能的重要依据。Lopez等学者〔4〕观察到体外培养的成骨细胞可在珍珠层表面贴附和生长，但未从细胞损伤、细胞生长和代谢特性等方面对珍珠层的生物相容性进行全面的、定性和定量的评价。本实验采用材料浸提液法从细胞形态、细胞结构、细胞生长和代谢特性等多方面评价生物活性材料珍珠层对人成骨细胞生物学功能的影响。Tsuchiya等学者认为浸出液法适合检测生物材料中一些易引起炎症反应和组织反应的溶出性物质的毒性，溶解释放物对生物体的毒性作用反映了固体材料主要的细胞毒性，并与动物毒性试验结果相符合〔5〕。本实验采用的评价指标符合国际标准组织（ISO10993-5）推荐的评价标准，与Lopez等学者的研究相比较，其结果更为准确与客观。

   本实验在设计中选用橡胶作为对照组，橡胶的浸出液中含有β萘胺类化合物、1，3二苯胍等有毒物质，通过比较成骨细胞在以上2种材料浸提液中的形态、结构和功能来评判生物活性材料珍珠层的生物相容性〔6〕。

   体外培养的细胞在有毒环境中细胞的形态和结构会发生一系列改变。在倒置显微镜下可见实验组细胞生长良好，细胞形态呈三角形或纺缍形，与正常成骨细胞形态相符合。对照组细胞生长不佳，形态呈圆形。透射电镜下可见实验组细胞结构正常，对照组中细胞结构被破坏。生物材料对细胞的毒性作用也反映在细胞膜的变化中，细胞膜结构和功能的完整对于维持细胞的生物学功能起重要作用。AOEB混合染色法可以用来检测细胞膜完整性。其原理是AO能进入胞膜完整的细胞而EB只能进入胞膜受损的细胞，因此，正常细胞和细胞膜损伤的细胞在荧光显微镜下发出不同的荧光。在本实验中实验组细胞膜完整性好，对照组细胞膜被破坏。

   除了形态变化外，细胞增殖和代谢等特性也会发生变化。体外细胞增殖周期包括4个时期：G1、S、G2及M期。S期细胞在DNA合成过程中需要摄入构成DNA的各种原料，BrdU与胸腺嘧啶结构相似，在DNA合成过程中能与胸腺嘧啶一样被摄入，故其摄入量可以代表暴露于材料浸提液中的细胞的增殖情况。MTT比色法可以反映材料浸提液对细胞数量及活性的影响，广泛用于检测骨替代材料的生物相容性。统计分析显示珍珠层与橡胶组测定值差异有显著统计学意义，因此可以认为，珍珠层对人成骨细胞的增殖和代谢活性无阻滞作用。

   综合本实验结果，可以看出生物活性材料珍珠层对人成骨细胞没有细胞毒性，具有良好的生物相容性，符合生物材料应用的基本要求，可以作为骨替代材料用于骨组织修复。

 
   ：

   〔1〕  Lamghari M,Berland S,Lopez E.Bone reactions to nacre injected percutaneously into the vertebrae of sheep［J］.Biomaterials,2001,22:555562.

   〔2〕  吴一民，陈建庭，孙炜，等.珍珠层人工骨促进成骨细胞的体外成骨能力［J］.矫形外科杂志，2003，11：217219.

   〔3〕  Falini G,Albeck S,Weiner S,et al.Control of aragonite polymorphism by mollusk shell macromolecules［J］.Science,1996,271:6769.

   〔4〕  Lopez E,Vidal B,Berland S,et al.Demonstration of the capacity of nacre to induce bone formation by human osteoblasts maintained in vitro［J］.Tissue Cell,1992,24:667679.

   〔5〕  Tsuchiya T.study on the standardixation of cytotoxicity tests and new standard reference materials useful for evaluating the safety of biomaterials［J］.Biomaterials,1994,9:138.

   〔6〕  Doglioli P,Scortecci G,Falatouni M.A novel spectrofluorometric technique for specific biocompatibility testing of implantable materials by cell culture.Report on use for multiparameter analysis of human osteoblasts cultured on commercially pure titanium and hydroxyapatite［J］.Cytotechnology,2001,35:93100.