细胞外信号调节激酶在高血糖加重脑缺血性损伤中的作用

【摘要】  目的 探讨ERK1/2在高血糖加重大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法 采用双侧颈总动脉管阻断加低血压法建立脑缺血再灌注模型，大鼠缺血前30min注射25％葡萄糖，使之处于高血糖状态。两侧颈总动脉结扎并放血，使血压下降到45～50mmHg。脑缺血30min后再灌注(解除颈总动脉结扎同时回输血液)，分别观察再灌注后30min、1h、3h、6h。另设正常血糖组和对照组，用免疫组化和Western blot比较3组大鼠ERK1/2的表达状态和脑组织病理改变。结果 正常血糖组和高血糖组大鼠，再灌注后0～1h，海马CA1区未见明显的ERK1/2表达。而在纹状皮质和海马CA3区，ERK1/2的表达有明显的区别。正常血糖组大鼠在再灌后30min，可见ERK1/2轻度升高，高血糖组大鼠再灌注后30min，ERK1/2升高。ERK1/2在再灌注1h达到高峰并且持续到再灌注3、6h，高于正常血糖组(P＜0.05)。用Western blot方法检测皮质和海马的ERK1/2含量，正常血糖组在缺血再灌注30min、1h、3h、6h ERK1/2含量逐渐升高，而高血糖组又高于正常血糖组(P＜0.05)。结论 高血糖可加重脑缺血再灌注损伤，其机制可能与激活ERK1/2有关。

【关键词】  细胞外信号调节激酶；高血糖；脑缺血；再灌注损伤

　　Abstract: Objective  To investigate whether ERK1/2 was involved in mediating hyperglycemia-exaggerated cerebral ischemic damage. Methods  Using bilateral carotid artery ligation upon the blood flow method，the model of cerebral ischemic reperfusion was established in rats. 25% glucose was injected at 30 min before the induction of ischemia to yield a glucose concentration more than 15mM. Cerebral ischemia was induced by bilateral clamping of the carotid artery plus hypotension to 45-50 mmHg by withdrawing and infusing blood. At the end of 30-min ischemia, the clamps were removed and the blood reinfused. The animals were anesthetized to allow collection of brains after 30 min, 1, 3 or 6h of reperfusion. In addition, normoglycemic group and control group were set. Then using immunohistochemistry and western blot compared with expression level of ERK1/2 and the pathological change among the rats in three groups. Results  No obvious expression of ERK was abserved in the hippocampal CA1 sector in either normoglycemic or hyperglycemic rats after 0h of reperfusion. In contrast there was a clear difference for the expression of ERK1/2 in the hippocampal CA3 sector and In the stride cortex area between normoglycemic and hyperglycemic rats. The number of positive cell in hyperglycemic group is significantly higher than that in the normoglycemic group after 30 min, 1, 3, 6 hours reperfusion. The signal of ERK1/2 detected by western blot in cortex and hippocampal: the lever of ERK1/2 gradually upregulated after 30 min,1,3,6 hours of reperfusion, the grade of ERK in hyperglycemic rats was significantly higher than in normoglycemics (P＜0.05). Conclusion  Preischemic hyperglycemia could augment the cerebral ischemic reperfusive injury. Hyperglycemia-exaggerated cerebral ischemic injury is related to the activation of ERK1/2.

　　Key words: extracellular signal-regulated kinase；hyperglycemia；cerebral ischemic；reperfusion injury

    动物实验和临床实验研究证明，高血糖可加重缺血再灌注后的脑损伤。缺血前高血糖除通过以下机制如兴奋性氨基酸的神经毒作用、自由基生成增加、钙离子超载、加剧对血脑屏障的破坏、介导炎症、引起细胞凋亡等加重脑缺血再灌注损伤［1-3］外，还与一种与蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)相关的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activited Protein Kinase，MAPK)超家族介导的细胞信号转导通路活化有关［3］。ERK1/2属于MAPK家族，主要通过丝裂原、ERK激活酶(MEK)或PKC参与的Ras-依赖性信号传导通道使其激活。为了明确MAPK在高血糖加重缺血性脑损伤中的作用，采用双侧颈总动脉阻塞法建立大鼠脑缺血模型，以高血糖与ERK1/2之间的关系为中心，运用免疫组化、Western-blot杂交等方法，从大鼠脑组织中MAPK家族ERK1/2的表达状态，研究MAPK与脑损伤和高血糖的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    雄性Sprague-Dewley大鼠50只，体重250～300g。由宁夏医学院实验动物中心提供。IgG抗体：ERK1(sc-94)，ERK2(sc-154)(Stanta Cruz Biotechnology公司产品)；MP3电泳装置(美国BIO-RAO公司产品)；凝胶成像仪(Bio-Rad Co.)；蛋白Mark(上海生物化学研究所监制)；硝酸纤维膜(Amersham Biosciences)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型

　　SD大鼠随机分为3大组：①高血糖脑缺血组(简称高血糖组，20只)，于脑缺血术前30min尾静脉注射25％葡萄糖4g/kg，造成高血糖状态；②正常血糖脑缺血组(简称正常血糖组，20只)，于脑缺血术前30min注射等量18％D-甘露醇；③高血糖及正常血糖假手术非缺血性(简称对照组，10只)。前两组用10％水合氯醛(400mg/kg)麻醉，分离双侧颈总动脉，从右侧颈总动脉向近心端插管，用抽血的方法放血，当血压下降到45～50mmHg时，结扎左侧颈总动脉，观察30min后，解除左侧颈总动脉结扎，同时将抽出的血全部输入体内，继续观察30min、1h、3h、6h四个时间点。迅速断头取脑一半大脑放于液氮中冷冻保存，用于Western blot检测。另一半大脑放于10％中性福尔马林中固定，进行HE及免疫组化染色。

　　1.2.2  免疫组化

　　免疫组化操作按照产品说明书进行，细胞胞浆内出现棕黄色颗粒状着染判断为阳性，出每高倍镜纹状皮质内阳性细胞数目，以及CA1区、CA3区1mm长范围内阳性细胞数目。

　　1.2.3  凝胶电泳和Western bloting分析

　　离心管中取出冷冻的脑组织，用预先冷冻的PBS洗涤，称量，匀浆器研磨，加入预冷的1×细胞裂解液(20mM Tris-HCl pH7.5，1mM EGTA，1mM EDTA，25μg/mL aprotinin，25μg/mL leupeptin，1mM sodium phrophosphate，500μM PMSF，4mM para-nitrophenyl-phosphate，1mM sodium orthovanadate)1mL将细胞裂解，蛋白定量，加热变性，然后加入10％分离胶，5％的浓缩胶蛋白电泳，SDS-PAGE后的聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维膜上，加入5％脱脂奶粉，4℃封闭过夜。常规洗涤，加一抗ERK1/2(1∶400)4℃过夜。常规洗涤，加入二抗37℃，1h。常规洗涤，加入4-氯-1-萘酸常温下显色。待显色完全后，用蒸馏水冲洗硝酸纤维膜，终止显色反应。经Bio-Rad Co.生物医学图象分析系统，对目的条带进行扫描和密度分析。

　　1.2.4  统计学方法

    利用SPSS 10.0 统计软件进行数理统计，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  一般情况

    正常血糖组和高血糖组、对照组的体重、体温差异无统计学意义，高血糖组血糖浓度明显高于正常血糖组。对照组脑组织无明显病理改变。正常血糖脑缺血组在缺血再灌注30min时，大脑皮质及海马有少量神经细胞间隙增宽，神经细胞轻度水肿，缺血再灌注1、3h后显示较明显的充血及水肿，有典型的神经细胞坏死。高血糖组在缺血再灌注30min、1h、3h、6h各时间点神经元损伤程度均比正常血糖组严重。

　　2.2  ERK1/2免疫组化染色结果

    正常对照组大鼠纹状皮质内有少量ERK1/2阳性神经元。正常血糖组，在缺血再灌注后30min～1h，纹状皮质ERK1/2阳性神经元的数目轻度瞬时升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。高血糖组大鼠，缺血再灌注30min后，ERK1/2表达显著升高(图1，见封4)，与正常血糖组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。表1  纹状皮质ERK1/2染色阳性神经元数目(略)

 

   对照组海马CA1区有少量ERK1/2表达，正常血糖组和高血糖组大鼠，缺血30min，再灌注后30min、1h、3h、6h，海马CA1区未见明显的ERK1/2表达增加，与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，详见表2。表2  海马CA1区ERK1/2表达的结果(略)

　　海马CA3区，ERK1/2表达有明显的区别(表3)。正常血糖组大鼠，在再灌30min后，未见ERK1/2的表达升高，再灌注1、3、6h表达升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。高血糖组大鼠再灌注后0h ERK1/2升高(图2，见封4)，再灌注1h达到高峰并且持续到再灌注3、6h，与正常血糖组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。表3  海马CA3区ERK1/2表达的结果(略)

　　2.3  Western blot结果

    Western检测发现在相对分子量35.5kD和50.7kD之间可见ERK蛋白杂交条带(图3)。经光密度扫描分析发现：高血糖组大鼠海马和纹状皮质脑组织ERK1/2蛋白含量高于正常血糖组和对照组(P＜0.05)，随着缺血再灌注时间的推移，ERK含量明显增加(表4)。表4  Western blot 中ERK1/2的表达（略）

　　3  讨论

    高血糖时除蛋白质非酶糖化、多元酶通路激活、氧化应激、PKC通路活化受到关注以外，与PKC相关的信号通路MAPK超家族介导的细胞信号转导通路成为近来研究的热点，它与细胞增生、凋亡、炎症密切相关［3-4］。本研究结果显示对照组ERK1/2的免疫组化为阳性，与对照组相比，正常血糖脑缺血再灌注组的ERK1/2免疫组化和Western blot阳性强度增加(P＜0.05)，而高血糖组ERK1/2阳性强度又显著比正常血糖组高(P＜0.05)。除神经元外，星形胶质细胞、小脑颗粒细胞也呈阳性表达。从上述结果得出，高血糖可明显刺激ERK1/2的表达，且与高血糖加重脑缺血再灌注损伤的部位一致，这与Hu等［5］的研究一致。

    在高血糖和糖尿病中可以发生MAPK通路的激活［6］。在鼠主动脉血管平滑肌细胞中，高血糖可以使MAPK表达水平升高4倍［7］。Xu等［8］用链脲霉素注射大鼠4周和20周后左侧大脑中动脉缺血再灌注。用Western blot检测ERK1/2磷酸化水平，高血糖4周后增加，而20周减少近1/3。研究表明短时间和长时间高血糖对心肌再灌注损伤起相反作用，这个相反的作用是由ERK1/2介导的细胞内信号通路决定的。而且Farrokhnia等［4］用免疫荧光和Western blot检测高血糖后缺血再灌注脑损伤时ERK和JNK的表达，发现在再灌注早期高血糖显著激活ERK的表达，JNK未见表达。体外研究表明［9］，高血糖可能通过抗氧化作用引起培养的神经元细胞的功能紊乱和凋亡。在高血糖条件下培养的PC12细胞，高血糖明显加重神经生长因子(nerve growth factor，NGF)介导的神经轴突的生长。而这是由NGF-介导的MAPK信号通路引起，特别是与在神经元生存/分化相关，MAPK ERK和凋亡/应激相关，MAPK p38和JNK之间的转化有关。

    本组用特异性抗体研究ERK1/2在正常血糖组、高血糖组及对照组大鼠脑组织中的空间分布和时间变化。正常血糖组大鼠缺血再灌后30min，在纹状皮质有ERK1/2的表达增加，但海马CA1区没有增加表达。与正常血糖组比较，ERK1/2在纹状皮质、CA3区的表达明显增加而且持续时间更长，而在CA1区没有变化。高血糖组大鼠缺血再灌注30min，ERK1/2在CA3区表达升高，在1h达到高峰并且持续高表达到3、6h。这反映了高血糖在细胞死亡中的两个阶段的不同作用：再灌注早期，高血糖增加线粒体呼吸和维持线粒体能量，但在后期通过未知通路促进细胞死亡［9］。这就说明再灌注时高血糖加重脑损伤不是由乳酸聚积引起，因为不论在正常血糖组还是高血糖大鼠细胞内外的pH水平在再灌注15～30min就恢复到正常水平。

    高血糖是通过哪种通道激活ERK2/1仍然不清楚。ERK1/2主要通过丝裂原、MEK或PKC参与的Ras-依赖性传导信号通路使其激活［2］。研究表明［1］，葡萄糖在大鼠肾小球和肾小球膜细胞、主动脉平滑肌细胞及脑组织中有促进PKC激活的作用，因此，高血糖可能通过激活PKC使得MAPK激活。MAPK一方面磷酸化并激活一种三元复杂因子ELK-1，而导致与增殖有关的c-fos和c-jun的表达；另一方面MAPK磷酸化并激活细胞浆磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)，活化的cPLA2接着引起花生四烯酸的释放增加，导致花生酸、血小板活化因子、溶血卵磷脂释放。所有这些生物脂类物质的释放，引起质膜甘油磷脂的丢失，导致膜通透性、离子稳态改变，增加自由脂肪酸的释放、脂质过氧化物的聚积，最终导致神经变性或凋亡［10］。

    总之，高血糖显著增加缺血再灌注大鼠脑组织纹状皮质，海马CA3区ERK1/2的表达。高血糖可能通过PKC激活ERK1/2，进而激活cPLA2，导致脂质过氧化物和氧化物损伤蛋白质膜，最终使细胞死亡。下一步检测MAPK阻断剂是否减轻高血糖对缺血性脑损害的加重作用，明确MAPK在高血糖加重脑缺血损害中的作用。

【】
  　　［1］Haneda M，Araki S，Togawa M，et al. Mitogen-activated protein kinase cascade is activated in glomeruli of diabetic rats and glomerular mesangial cells cultured under high glucose condition［J］. Diabetes，1997，46：847-853.

　　［2］Seger R，Krebs EG. The MAPK signaling cascade［J］. FASEB J，1995，9：726-735.

　　［3］Li PA，He QP，Ouyang YB，et al. Phosphorylation of extracellular signal-regulated after transient cerebral ischemia in hyperglycemic rats［J］. Neurobiol Dis，2001，8(1)：127-135.

　　［4］Farrokhnia N，Roos MW，Terent A，et al. Differential early mitogen-activated protein kinase activation in hyperglycemic ischemic brain injury in the rat［J］. Eur J Clin Invest，2005，35(7)：4574-63.

　　［5］Hu BR，Liu CL，Park DJ. Alteration of MAP kinase pathways after transient forebrain ischemia［J］.J Cereb Bood Flow Metab，2000，20：1089-1095.

　　［6］Atkins CM，Yon M，Groome NP，et al. Regulation of myelin basic protein phosphorylation by mitogen-activated protein kinase during increased action potential firing in the hippocampus［J］. J Neurochem，1999，73(3)：1090-1097.

　　［7］Lin LL，Wartmann M，Lin AY，et al.cPLA2 is phosphorylated and activated by MAP kinase［J］. Cell，1993，72(2)：269-278.

　　［8］Xu G，Takashi E，Kudo M， et al. Contradictory effects of short- and long-term hyperglycemias on ischemic injury of myocardium via intracellular signaling pathway［J］.Exp Mol Pathol，2004，76(1)：57-65.

　　［9］Wagner KR，Myers RE. Hyperglycemia preserves brain mitochondrial function during anxia［J］. J Neurochem，1986，47：1620-1626.

　　［10］Faroorui AA，Horrocks LA. Lipid peroxides in the free radical pathophysiology of brain diseases［J］. Cell Mol Neurobiol，1998，18：599-600.