细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定

【摘要】  目的 构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus，Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein，HSP70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法 从重组质粒HSP70/pGEM-T中酶切HSP70目的片段，亚克隆入表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达，经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化，SDS-PAGE 和Western blot方法鉴定表达产物。结果 成功构建Eg.HSP70/ pET-28a/ E.coli BL21基因工程菌株，诱导表达重组蛋白和纯化分离得到14kDa Eg.HSP70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论 初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。

【关键词】  细粒棘球蚴；热休克蛋白HSP70；表达；纯化；免疫鉴定

　　Abstract: Objective  To const ruct HSP70 gene gene and express prokaryotically it , to purify and identify the immunogenicity of recombinant HSP70 protein. Methods  Eg.HSP70 gene was attained from Eg.HSP70/pGEM-T recombinant plasmid and subcloned into high level expressed vector pET-28a. E.coli BL21(DE3)plys was sonst ructed. Western blot and ELISA were used to identify the immunogenicity of the recombinant protein. Results  E.coli BL21(DE3)plys srecombinant plasmid was const ructed. Western blot analysis showed that recombinant protein and protoscolex , cystic fluid and cystic wall of 14kDa Eg.HSP70 could be recognized by this antibody.Conclusion  pET-28a/HSP70 recombinant plasmid is constructed and expressed efficiently. The antigenicity and immunogenicity of Eg.HSP70 protein is identified.

　　Key words: Echinococcus granulosus；heat shock protein70；protein expression；purification；immunological identification

    细粒棘球蚴病(Echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg.)幼虫引起的一种人畜共患寄生虫病，呈世界性分布。我国是包虫病流行的严重地区。目前包虫病的主要以手术及药物治疗为主，但存在复发率高等缺点。随着分子生物学技术的，近年来对包虫病的分子疫苗研究取得了可喜进展［1］。本研究通过构建Eg.HSP70/ pET-28a/E.coli BL21基因工程菌株，旨在为筛选包虫疫苗的候选抗原基因打下基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  质粒、菌株和试剂

　　质粒HSP70/pGEMT［2］、兔多克隆抗血清［3］由本室保存，E.coli BL21(DE3)plysS、pET-28a、His-bind树脂纯化试剂盒购自Novagen公司。质粒提取纯化试剂盒、蛋白分子质量标准、羊抗兔IgG-HRP、均为华美生物公司产品。限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ购自北京赛百盛基因技术有限公司。T4DNA Lingase及IPTG购自Promega公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  重组表达质粒Eg.HSP70/pET-28a的构建及鉴定用BamHⅠ、NotⅠ同时对已构建的Eg.HSP70/pGEMT重组质粒和表达载体pET-28a进行双酶切，将目的片段与pET-28a在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入感受态细菌E.coli BL21(DE3)plysS，并在含有卡那霉素(终浓度为50μg/mＬ)的YT培养基中，37℃培养过夜。筛选阳性菌落提取质粒，用BamHI和NotI酶切鉴定。构建过程如图１所示。

　　1.2.2  重组蛋白的诱导表达

　　将重组菌接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的3mL YT培养基中，37℃，220r/min振荡培养数小时，按1∶50接种于50mL培养基中培养至OD600=0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，分别调至28、30和37℃振荡培养过夜，通过不同IPTG浓度、温度和培养时间来优化诱导表达条件。4000r/min离心10min，弃上清，收集细菌沉淀和诱导表达前的菌液，通过SDS-PAGE进行鉴定。

　　1.2.3  重组蛋白的纯化

　　重组蛋白Eg.HSP70/6His用含Ni2+的His-bind树脂亲和层析柱对重组蛋白Eg.HSP70/6His进行纯化。从试剂盒中取100μL树脂悬液于一个1.5mL EP管，依次用去离子水、1×charge buffer、1×binding buffer平衡处理，加入细胞裂解液中的上清与树脂结合，最后用1×Elute buffer 300μL洗脱Eg.HSP70/6His重组蛋白，通过SDS-PAGE进行鉴定并在凝胶成像仪上用Quantity One软件分析重组蛋白纯化浓度。

　　1.2.4  免疫印迹实验(Ｗestern blot)

　　用HSP70/6His重组蛋白通过180V电压SDS-PAGE电泳1h，按常规方法(电流300mA)印迹转移1h。然后将硝酸纤维膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中，37℃封闭2h，以1×PBS-T(含0.5‰Tween-20)洗3次，每次5min；将硝酸纤维膜剪开分别浸泡于1∶100稀释的兔多克隆抗血清及正常兔血清中，4℃过夜；次日将膜与1∶100稀释的羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)在37℃摇床上反应2h，再以1×PBS-T溶液洗4次，每次10min，加入新配制的显色液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL 1×TBS，12μL H2O2)显色5min，最后用蒸馏水冲洗终止反应。

　　2  结果

　　2.1  重组表达质粒HSP70/pET-28a的酶切鉴定

    将构建的重组表达质粒HSP70/pET-28a用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测到插入片段大小约402bp，与目的基因片段相符(图2)。

　　2.2  重组蛋白的诱导表达鉴定

    经SDS-PAGE鉴定，重组蛋白在不同IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM)诱导下表达量差别不大；在不同温度(37℃、30℃、28℃)诱导表达下，以37℃表达量最高；在不同时间(1h、2h、3h、4h、5h、过夜)诱导表达下，以过夜表达量最高。

    重组蛋白Eg.HSP70/6His经His-bind树脂纯化试剂盒纯化后SDS-PAGE电泳，显示1条蛋白带，分子量约为14kD(图3)。

　　2.4  Western blot 鉴定

    用原头蚴免疫的兔多克隆抗血清识别重组蛋白，在14kDa处有明显识别条带，以上条带均不被正常兔血清识别(图4)，初步说明该重组蛋白具有与天然抗原相同的抗原表位。

　　3  讨论

    热休克蛋白是原核细胞和真核细胞在不良因素作用下所产生的一组特殊蛋白质，在进化上高度保守。根据同源程度及分子量大小，可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、及小HSP家族。其中HSP70是HSP家族中最保守和最主要的一类，具有“分子伴侣”等多种重要的生理功能［4-6］，在免疫中可作为佐剂、抗原载体，在基因疫苗中可提高专一性免疫效果［7-8］。与互联网上已发表细粒棘球蚴HSP70核苷酸序列(意大利株)相比，同源性为96％，推导编码氨基酸序列同源性为81％。与其它动物HSP70氨基酸的同源性分析结果显示具有高度的保守性。该基因片段的获得使下一步蛋白表达和动物免疫保护研究工作成为可能。

    丁淑琴等［2，9］以本地包虫病人的细粒棘球蚴原头蚴为材料提取获得总RNA为模板，用基因工程方法获得Eg.HSP70基因，并重组至表达质粒载体pGEX-6P-1进行诱导表达、纯化分离获得重组HSP70/GST融合蛋白及目的蛋白Eg.HSP70，通过动物实验初步鉴定其具有较好的免疫原性。
   
　　为进一步研究和分析抗原分子Eg.HSP70对宿主形成的免疫保护水平及其免疫机制，需进行动物攻击感染保护性实验，首先要求纯化大量的抗原分子Eg.HSP70。已构建的重组表达质粒Eg.HSP70/pGEX-6P-1需用特异性蛋白解离酶
PreScissonTM Protease剪切载体表达产物GST分离目的蛋白［10-11］，其步骤繁琐、费用昂贵、且纯化蛋白量少。本研究弥补了以上不足，使目的蛋白纯化更为方便。从重组质粒Eg.HSP70/pGEMT中分离Eg.HSP70目的基因，将该片段亚克隆至表达载体pET-28a，重新构建重组表达质粒Eg.HSP70/pET-28a(pET-28a载体表达产物带6个组氨酸，不改变融合蛋白Eg.HSP70/6His的活性，便于纯化、回收)，再转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS。
   
　　我们通过优化诱导表达条件，采用37℃、IPTG浓度0.5mM，过夜诱导的方法表达融合蛋白，经His-band树脂纯化试剂盒纯化获得14kDa的融合蛋白Eg.HSP70/6His，通过Western blot证实Eg.HSP70/6His能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别，初步说明该重组蛋白具有与天然抗原相同的抗原表位，可望作为包虫病疫苗候选分子。

【】
  　　［1］章家新，傅玉才.包虫病的疫苗研究进展［J］. 汕头大学医学院学报，2002，15(2)：118-120.

　　［2］丁淑琴，赵嘉庆，王娅娜. 细粒棘球蚴热休克蛋白70基因的克隆和序列分析［J］.宁夏医学杂志，2005，27(8)：507-509.

　　［3］赵嘉庆，王娅娜，王健，等.细粒棘球蚴抗血清的制备及特性鉴定［J］.宁夏医学院学报，2005，27(3)：234-236.

　　［4］陈君.热休克蛋白70家族的功能和在神经保护中的作用［J］.国外医学麻醉学与复苏分册，2003，24(3)：154-157.

　　［5］王笑虹，苗迎秋，宋光.热休克蛋白70生物学功能研究的新进展［J］.大连大学学报，2003，24(2)：103-106.
　
　　［6］蒋而康.热休克蛋白70在免疫中的作用及应用［J］.国外医学免疫学分册，2003，26(1)：57-58.

　　［7］Javier Martinez，Jorge Perez-Serrano，et al. Heat shock proteins HSP70 and HSP60 in Echinococcus granulosus protoscolices［J］. Folia Parasitological，1999，46：76-78.

　　［8］Christopher J，David J. HSP70 expression and function during embryogenesis［J］.Cell Stress Chapreones，1999，4(3)：162-170.

　　［9］丁淑琴，王娅娜，王洁. 细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和鉴定［J］.人兽共患病杂志，2006，22(8)：764-766.

　　［10］(美)J.萨姆布鲁克，DW拉塞尔著.分子克隆实验指南［M］.第3版.北京：出版社，2002：1245-1248.

　　［11］Cordingley MG，Callahan PL，Sardana VV，et al. Substrate Requirements of Human Rhinovirus 3C Protease for Peptide Cleavage in Virtro［J］.J Bio Chem，1990，265(16)：9062-9065.