射频能量在治疗关节软骨退变中对软骨细胞及基质的影响
作者：孙建华 刘维钢 史晨辉 王永明 董金波 李宽新 何斌
【关键词】 细胞死亡
摘要：［目的］实验研究射频消融能量大小与关节软骨细胞及基质损伤效应之间的关系。［方法］建立牛膝关节软骨退变模型，模拟膝关节镜环境，射频消融气化仪在15、40、70 W的不同能量设置条件下，处理牛膝关节退变软骨1 min，同时设置对照组，共分4组，每组6份标本，随后行软骨组织块培养，HE染色，FDA／PI双荧光染色，GAG释出率。［结果］随着射频消融能量的增加，空泡率明显增加，软骨细胞死亡率明显增加，GAG释出率明显减少。［结论］随着射频消融输出能量的增加，软骨细胞死亡率明显增加，软骨基质损伤明显加重，射频消融能量大小与关节软骨细胞及基质的损伤呈正相关关系。
关键词：射频消融；细胞死亡； 细胞外基质
Effects of radiofrequency energy on degenerative articular
Abstract：［Objective］To study the effect of radiofrequency energy on chondrocytes and matrix of traumatic degenerative articular cartilage［Method］Traumatic degenerative arthritis models were established in 24 bovine knees,which were divided into 4 groups:15w group (A),40w group(B)70w group (C) and control group untreated(D)After the degenerative cartilages of group A,B,C were treated respectively for 1 min with 15w,40w,70w radiofrequency energy,the cartilage blocks were cultured and examined with HE stain and FDA (flurescein diacetate) /PI (propidium iodide) double fluorescent stain,and GAG (glucosamineglucan) release rate was measured［Result］Followed the enhance of radiofrequency energy strength,the vacuolization rate and mortality rate of cartilage cells were correspondently increased (P＜005),but GAG release rate was decreased (P＜005)［Conclusion］The results shows that there are positive correlation between the strength of radiofrequency energy and degree of matrix damage as well as mortality of cartilage cells
Key words：Radiofrequency energy； Degenerative cartilage； Arthritic knee
射频技术在关节软骨成形术中的应用日益广泛。但由于关节软骨缺乏神经、血管及淋巴系统，受损后自身修复能力有限，而射频产生的热量可能对软骨细胞及基质有损伤效应〔1〕。因此射频能量在软骨成形术中的安全性目前逐步受到重视。作者在模拟关节镜环境下，对比研究不同射频消融能量对正常软骨细胞的即时损伤，报道如下。
1 材料与方法
11 标本及分组
111 关节软骨退变模型制作及设备准备
当地屠宰场得到新鲜完整的牛膝关节6副，无菌条件下暴露股骨髁部关节软骨面，刀片轻轻刮除表面软骨膜，骨锉锉光关节软骨表面，制作Ⅱ级软骨退变模型。射频消融设备是SERFAS双极射频气化仪(Stryker公司)，消融电极型号为278500350。
112 标本分组及参数设定
射频消融对象以单元格为单位，每幅牛膝关节软骨选择4个单元格(1 cm×1 cm)。参数设定选择CUT1、CUT3、CUT5，相对应输出能量为15、40、70 W，其中选3个单元格分别用相应射频消融能量处理1 min，另一组未经射频消融能量处理的单元格作为正常对照组。共分4组，每组6份标本。
12 标本培养
关节软骨处理后，日期记录为第1 d，依照网格线全层取下关节软骨，沿中央切开，分为A、B两部分，A组织块(1 cm×05 cm)直接放入24孔培养板培养(DMEM培养基，100 ml／LFBS，37 ℃ 50 ml／L CO2)，用于软骨细胞活性检测。B组织块天平称质量并记录，无菌下切成1 mm×1 mm×1 mm小块，放入24孔培养板培养，加入培养基10 ml，用于葡糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）释出率测定。每日换液。
13 软骨组织块即时损伤观察指标
131 HE染色
培养后第4 d，将A组织块分为A1、A2 2部分，将A1组织块放入10%福尔马林溶液中固定，经脱水、透明、制作蜡块、切片、HE染色，在显微镜下观察，坏死细胞的细胞核散大、消失，呈空泡状。高倍镜下取10个视野（表层5个，中层5个），细胞空泡率=空泡细胞/细胞总数×100%。
132 细胞活性检测
培养后第2 d，A2组织块用双面剃刀切成05 mm薄片，放入含3 mg/L二乙酸荧光素（flurescein diacetate,FDA)PBS液中，37 ℃孵育5 min，然后，放入含10 mg/L碘化丽啶（propidium iodide,PI）PBS液孵育1 min，PBS液冲洗3遍，倒置荧光显微镜下观察。在蓝色激发光下活细胞呈绿色，在红色激发光下死细胞呈鲜红色。使用双重曝光拍照，每份切片取6个视野（表层3个，中层3个）死亡率=死亡细胞/（死亡细胞+活细胞）×100%。
133 软骨组织GAG释出率测定
第4 d，把B组织块前3 d收集的培养基用阿利新蓝法测定GAG（glycosaminoglycan）含量〔2〕。根据组织块的原始质量，换算成GAG释放率。GAG相对释出量=GAG含量/组织块质量。
统计学处理：应用SPSS 110统计软件，进行单因素方差分析法。
2 结果
21 HE染色
对照组空泡率为1896%，15 W为2795%，与对照组相比，差异无显著性（P＞005）。当输出能量增加至40、70 W时，软骨细胞空泡率分别增加至5507%、6513%，与对照组相比，软骨细胞空泡率明显增加（P＜005),结果见表1。
22 细胞活性检测
对照组死亡率为1783%，15 W为4465%，两组相比，差异无显著性（P＞005）。当输出能量增加至40 W及70 W时，软骨细胞死亡率为100%，与对照组相比差异具有显著性（P＜005），结果见表1。表1 细胞活性检测软骨细胞空泡率及死亡率(略)注：*与对照组比较
23 软骨组织GAG释出率测定
射频消融输出能量达到15 W时，前2 d GAG相对释出率较对照组虽无显著性差异（P＞005），但释出率已经开始下降，输出能量增加至40 W及70 W时，GAG相对释出率较对照组下降明显（P＜005）,第3 d，各组间GAG相对释出率差异虽不显著（P＞005），但随着输出能量的增加，GAG相对释出率仍在减少，结果见表2。表2 软骨组织GAG释出率(略)注：*与对照组相比P＜005
3 讨论
31 射频消融能量大小对关节软骨细胞的影响
目前在软骨成形术中，对射频消融能量安全性的认识并不一致〔1〕。本研究HE染色结果显示，对照组空泡率为1896％，15 W组为2795％，与对照组相比，差异无显著性(P＞005)。当输出能量增加至40、70 W时，软骨细胞空泡率分别增加至5507％、6513％，与对照组相比，软骨细胞空泡率明显增加(P＜005)。荧光染色结果显示，对照组死亡率为1793％，15 W组为4465％，两组相比，差异无显著性(P＞005)。当输出能量增加至40 W及70 W时，软骨细胞死亡率为100％，与对照组相比差异具有显著性(P＜005)，且变性、坏死的空泡细胞与死亡的软骨细胞多集中于软骨表层。提示随着射频消融输出能量的增加，处理区域死亡的软骨细胞也随之增加，表层软骨细胞因离电极较近，较中层及底层软骨细胞相比，受到更多射频输出能量的损伤，因此，更容易发生变性、坏死。当射频消融输出能量超过40 W，处理时间超过1 min时，即可能造成全层软骨细胞死亡，射频消融输出能量大小与处理区域软骨细胞损伤效应之间存在明显的正相关关系，也就是说，随着射频消融输出能量的增加，对处理区域正常软骨细胞损伤也就越大。本研究结论与Ryan〔3〕的研究结论相符，Ryan认为双极射频的能量超过20 W，即可对软骨细胞及基质产生损伤效应，并且随着能量的增加，这种损伤效应也会明显增加。基础研究同时提示，部分软骨缺损用消融能量处理6个月后，软骨细胞活性明显下降〔1〕，说明射频消融能量对软骨细胞活性的影响是长期的、永久性的。以上观点与Kaplan〔5〕及Keefe〔6〕观点并不一致，他们研究发现在射频消融处理区域，软骨细胞仍保持活性，未发现软骨胶原纤维异常，软骨磨损区变得更为平滑，因此，他们认为射频能量对关节软骨影响较小，使用相对安全。
32 射频消融能量大小对关节软骨基质的影响
GAG是由软骨细胞胞内合成分泌到胞外间隙去的，是软骨细胞外间隙的主要成分。本研究结果显示，射频消融输出能量达到15 W时，前2 d GAG相对释出率较对照组虽无显著性差异(P＞005)，但释出率已经开始下降，输出能量增加至40 W及70 W时，GAG相对释出率较对照组下降明显(P＜005)，第2 d，各组间GAG相对释出率差异虽不显著(P＞005)，但随着输出能量的增加，GAG相对释出率仍在减少。提示射频消融能量影响了软骨细胞活性，从而影响了软骨细胞合成、分泌基质的能力，随着能量的增加，这种损伤效应会明显增加，呈现明显的正相关性。本研究结论与Ryan〔3〕的研究结论相符，Ryan认为随着双极射频能量的增加，软骨组织蛋白多糖的合成代谢明显减少，而分解代谢明显增加，说明软骨基质损伤效应随着能量的增加而明显加重。
33 组织学改变作为早期判断软骨细胞活性指标敏感性的探讨
组织学改变作为早期判断软骨细胞活性指标的敏感性在中已有报道，Kaplan〔5〕等报道射频消融能量是安全的，而Ryan〔3〕认为这一结果可能与其采用的组织学观察指标不敏感有关，因此，Ryan建议在相关的研究中，应当采用较敏感的检测指标。本研究结果显示，射频输出能量达到15 W时，HE染色，软骨细胞空泡率达2795％，荧光染色，软骨细胞死亡率达4465％。在40 W及70 W组，荧光染色对软骨细胞活性检测，其死亡率均为100％，而软骨细胞空泡率分别为5507％、6513％，两种检测方法所显示的软骨细胞死亡率差别较大，而GAG释出率测定结果与荧光染色结果相一致，40 W组与70 W组荧光染色显示软骨细胞死亡率为100％，相对应第3 d的GAG释出率测定结果几乎为0，以上现象提示，死亡细胞的细胞核由溶解、消散转化为组织学上的空泡细胞，需要一定时间，因此，射频消融输出能量对软骨细胞影响的组织学上的变化，与荧光染色及GAG释出率测定相比较，敏感性较低，能不能作为软骨细胞及基质损伤的早期判断指标，进而得出射频消融对关节软骨是安全的结论，需要进一步探讨。
34 小结
上述结果提示，随着射频消融输出能量的增加，对处理区域软骨细胞及基质的损伤效应也会明显增加。在1 cm×1 cm软骨单元格内，15 W的射频输出能量，处理时间1 min，对软骨细胞及基质的损害较轻，可能相对安全。因此，在关节软骨成形术中，运用射频消融处理退变软骨时，建议选用低能量，该结论与敖英芳等〔7〕有关射频消融处理退变软骨时，输出能量不宜过高的观点一致。
4 结 论
本组实验研究表明，双极射频消融能量关节软骨退变时，对正常关节软骨与基质是有损害的，这种影响与射频消融能量呈正相关，能量超过15 W时，对关节软骨活性及基质影响非常明显，可能会造成全层关节软骨的坏死。所以，在无明确研究结论之前，临床上在软骨成形术中，要谨慎使用双极射频消融能量。
文献：
〔1〕王立勋,摘译.射频能量在治疗关节软骨面不平中对软骨细胞及基质的作用［J］.国外医学骨分册，2004，25(2)：127128.
〔2〕 张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.第2版，上海：上海科技出版社，1988，290.
〔3〕 Ryan A,Bertone AL,Kaeding CC，et al.The effects of radiofrequency energy treatment on chondrocytes and matrix of fibrillated articular cartilage［J］.Am J Sports Med,2003,31(3):386391.
〔4〕 Lu Y,Hayashi K,Hecht P,et al.The effect of monopolar radiofrequency energy on partialthickness defects of articular cartilage［J］.Arthroscopy,2000,16(5):527536.
〔5〕 Kaplan.The acute effects of radiofrequency energy in articular cartilage［J］.Arthroscopy,2000,16(8):877878.
〔6〕Keefe MW,Rasouli A,Telenkov SA,et al.Radiofrequency cartilage reshaping:efficacy,biophysical measurements,and tissue viability［J］.Arch Facial Plast Surg,2003,5(1):4652.
〔7〕敖英芳，于长隆，焦晨,等.射频气化仪在关节镜手术中的应用［J］.微创外科杂志,2001，1(2)：103105.
