宁夏回、汉族人群5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性研究

【摘要】  目的 研究宁夏地区回、汉族人群及不同性别5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methy lenetetrahy drofolate reductase，MTHFR)C677T多态性的分布特点。方法 应用限制性片段长度多态性扩增技术(PCR-RFLP)及DNA测序法分析宁夏地区146例回族和169例汉族人群及回汉族男、女性MTHFR C677T基因型的分布频率。结果 宁夏汉族人群MTHFR C677T基因型频率分别为C/C 20.4%、C/T 54.5%和T/T 24.8%，回族为C/C 8.2%、C/T 88.4%和T/T 3.4%，二者差异有统计学意义(P＜0.005)。回族男性该基因型频率分别为7.1%、88.6%和4.3%，女性为9.2%、88.2%和2.6%(P＞0.05)；汉族男性为26.0%、46.3%和27.7，女性为17.4%、59.1%和23.5%(P＞0.05)。结论 宁夏地区回、汉族MTHFR C677T的三种基因型CC、CT、TT的分布存在差异，三种基因型的分布在性别间未见差异。

【关键词】  回族；汉族；宁夏；5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶；遗传多态性

　　Abstract：Objective  To investigate the frequencies of the allele and genotype of MTHFR C677T between Hui and Han Population in Ningxia. Methods  Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and direct DNA sequencing were used to detect the genetic genotype. The genetic polymorphism distribution of MTHFR C677T between the 146 Hui nationalities and 169 Han nationalities in Ningxia were compared. Results  The genotype frequencies of MTHFR C677T in Han population were C/C 20.4%,C/T 54.5%,T/T 24.8% and in Hui population were C/C 8.2%, 88.4%, 3.4% respectively. The genotype frequencies of male and female in Hui were 7.1%, 88.6%, 4.3%；9.2%, 88.2%, 2.6% respectively. And the genotype frequencies of male and female in Han were 26.0%, 46.3%, 27.7%；17.4%, 59.1%, 23.5%, respectively. Conclusion  There is a significant difference between Ningxia Han and Hui in genetic polymorphism distribution of the MTHFR C677T (P＜0.05). And there is not a significant difference between male and female both in Ningxia Hui and Han of genetic polymorphism distribution of the MTHFR C677T (P＞0.05).

　　Key words：Hui population；Han population；Ningxia；5’10-methylenetetrahydrofolate reductase；genetic polymorphism

    5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methy lenetetrahy drofolate reductase，MTHFR)是一种重要的叶酸代谢酶，它在体内催化5，10-甲基四氢叶酸还原为体内最主要的甲基供体-5‘甲基四氢叶酸，具有重要的生理功能。至今已发现MTHFR基因有15种导致改酶缺陷的突变［1］，其中C677T突变导致酶的热不稳定性缺陷，可引起高半胱氨酸血症，并与多种疾病的发病风险有关［2］。正常人群中MTHFR基因第677位核苷酸多态性的分布存在群体差异，这种差异可能与人群对多种疾病的群体易感性有关。宁夏回、汉族人群该位点的分布特征尚未见报道。本研究旨在分析宁夏回、汉族人群MTHFR C677T的分布特征，获得该多态性位点的宁夏群体遗传学数据。

　　1  材料和方法

　　1.1  研究对象

    研究对象均来自三级甲等门诊体检健康且祖居宁夏的回、汉族个体。回族146人，其中男性 70人，年龄 18～22岁，平均年龄(20±2)岁；女性 76人，年龄 19～21岁，平均年龄(20±1)岁。汉族169人，其中男性 54人，年龄19～21岁，平均年龄(20±1)岁；女性115人，年龄18～19岁，平均年龄(19±1)岁。

　　1.2  方法

　　1.2.1  提取外周血DNA

    抽取静脉血3～5mL，EDTANa02抗凝，采用北京赛百盛基因公司的树脂型基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，保存于TAE液中(浓度为0.1mg/L)，并置-4℃冰箱保存。

　　1.2.2  PCR扩增

    引物设计并合成根据Frosst等［3］报道的突变cDNA序列设计上游引物P1：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGG GA-3’；下游引物P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAAGAGTG-3’采用多聚酶链反应限制性内切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。PCR反应体系总体积为50μL，含ddH2O35μL，10×buffer(Mg2+)5μL，10 pmol/μL，引物各1.5μL，100μmol/L dNTPs1μL，TagDNA聚合酶1μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，再延伸7min。PCR产物为198bp的DNA片段，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果，紫外灯下鉴定。

　　1.2.3  HinfI酶切及产物鉴定

    在20μL反应体系中进行酶切，ddH2O 5μL，Buffer 2μL，PCR产物12μL，HinfI酶1μL，37℃水浴4h，酶切产物由12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，goldview染色观察结果。经HinfI酶切产生3种基因型，分别为野生型(CC)、杂合突变型(CT)、纯合突变型(TT)。产生的多态性片段分别为198bp、198bp和175bp、23bp，以及结果175bp、23bp。酶切结果(图1)，经北京利嘉生物公司测序结果(图2，见封2)。

　　2  结果

　　2.1  群体代表性检验

　　宁夏回、汉族及男女的MTHFR C677T基因型和等位基因的分布，经χ2检验，P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象来自同一群体，具有较好的代表性。
M：Marker为500/400/300/200/100/25bp，最亮为400bp，其中1和4泳道为杂合突变型，为198bp和175bp；2和3泳道为纯合突变型，为175bp；5泳道为野生型，为198bp。

　

　2.2  宁夏回、汉族MTHFR C677T基因型和等位基因型的频率分布

　　宁夏地区回、汉族MTHFR的3种基因型CC、CT、TT的分布差异具有统计学意义(P＜0.05)，回族正常人群T纯合型突变频率较低，低于宁夏汉族正常人群(见表1)。表1  宁夏回汉人群MTHFR C677T基因型频率的比较（略）

　　2.3  宁夏回汉不同性别的MTHFR C677T基因型频率分布

　　宁夏地区回族男、女和汉族男、女的MTHFR基因型CC、CT、TT的分布差异无统计学意义，P＞0.05(见表2)。表2  宁夏回汉不同性别的MTHFR C677T基因型频率分布（略）

　　3  讨论

    人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3上，cDNA全长2.2kb，含有11个外显子和10个内含子，且具有高度多态性。由于C677T位于MTHFR催化区域，该突变直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性，因此目前很多疾病的研究都集中在此多态性位点上。据报道，MTHFR基因C677T突变分布在爱尔兰正常人群中T纯合型突变频率约为6.1％，荷兰人约为5.2％，法籍加拿大人约为12％［4］，欧洲人约为35％［5］，而在美国，Hanson等［6］调查了1238名受试者，T纯合型突变约占11.4％，杂合型突变47.2％，野生基因型41.3％。亚洲各地分布也不尽相同，泰国人中T纯合基因型约占1.4％，杂合基因型25.6％，远低于韩国和日本，与非洲黑种人接近［7］。在，Zheng等［8］调查了122名正常受试者约12.3％(95％CI 6.3％～19.6％)为T纯合基因型。Zhang等［9］分析了100例中国南方正常人群MTHFR基因C677T突变频率T纯合基因突变频率为16％。Sun等［10］对96例西安汉族人进行基因分型后发现，西安地区汉族人其C677T等位基因频率为45％，TT纯合子占18％，C677T等位基因及突变纯合子TT频率高于日本人和非洲美洲人。许海燕等［4］调查显示中国人群中T纯合基因型频率约为20.5％。由此可见，MTHFR基因在人群分布呈遗传多态性。本研究结果显示宁夏地区回、汉族正常人群MTHFR C677T 3种基因型频率C/C、C/T、T/T分别为8.2%、88.4%、3.4%；20.7%、54.5%、24.8%，表明宁夏地区汉族正常人群与国内报道的北方地区T纯合型突变频率接近，且突变频率较高，男女性别差异无统计学意义(P＞0.05)。而宁夏地区回族正常人群T纯合型突变频率较低，显著低于宁夏汉族人群与爱尔兰和荷兰人接近，且男女性别差异无统计学意义(P＞0.05)。本文为进一步研究MTHFR C677T基因多态性与疾病相关性研究提供了。

【参考文献】
  　　［1］Goyette P，Pai A，Mos R，et al.Gene structure of human and mouse methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)［J］. Mamm Genome，1998，9：642-656.

　　［2］Kang SS，Gian PR，Milos R，et al. Intermediate hyperhomocysteinemia resulting from compound heterozygosity of methylenete trahydrofolate reductase mutations［J］. Am J Hum Genet，1991，48(3)：456-551

　　［3］Frosst P，Pepe G，Camacho Vanegas O et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease：a common mutation in methyl lenetetrahydrofolate reductase［J］. Nat Genet，1995，10(1)：111-113.

　　［4］许海燕，陈在嘉，汤健，等.冠心病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性的研究［J］.中华医学杂志，1999，79(6)：414-415.

　　［5］Rees DC，Liu YT，Cox MJ，et al.Factor V Leiden and thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase in extreme in old age［J］. Tromb Haemost，1997，78(5)：1357-1360.

　　［6］Hanson NQ，Aras O，Yang F，et al.C677T and A1298C polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene：incidence and effect of combined genotypes on plasma fasting and post-methionine load homocysteine in vascular disease［J］.Clin Chem，2001，47(4)：661-662.

　　［7］Angchaisuksiri P，Pingsat BS，Sura T，et al.Prevalence of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation in Thai patients with deep vein thromobosis［J］.Acta Haematol，2000，103(4)：191-192.

　　［8］Zheng YZ，Tong J，Do XP，et al.Prevalence of methylenetetrahydrofolate reductase C677T and its association with arterial and venous thrombosis in the Chinese population［J］.Br J Haematol，2000，109(4)：870-188.

　　［9］ZhangG，DaiC.Genepolymorphi smsofhomocysteine metabolism-related enzymes in Chinese patients with occlusive coronary artery or cerebral vascular disease［J］. Thromb Res，2001，104(3)：187-188.

　　［10］孙文萍，万琪，苏明权.西安地区汉族亚甲基四氢叶酸还原酶的两种基因多态性［J］.第四军医大学学报，2003，24(7)634-636.