人胸椎黄韧带BMP
作者 顾树明 田纪伟 徐林 贾连顺
【关键词】 人胸椎
摘要：［目的］研究不同年龄组胸黄韧带中BMP2和TGFβ基因表达。［方法］利用BMP2和TGFβ cDNA探针，对不同年龄组的黄韧带冰冻切片进行原位杂交，用VIDAS图像分析仪分析。［结果］20岁以下组，有明显的TGFβ表达，无BMP2表达；21~40岁组，黄韧带的附着点处有少量的BMP2和TGFβ阳性表达信号。41~60岁组，在附着点处TGFβ表达较弱，但BMP2表达相对增强。61岁以上组，TGFβ无表达，附着点处有呈簇状BMP2阳性表达信号。VIDAS图像分析显示各组间差异有显著性。［结论］随着年龄的增长，TGFβ表达逐渐减弱，在附着点处出现BMP2的表达。
关键词：人胸椎；黄韧带； BMP2和TGFβ; 基因表达
Abstract：［Objective］To observe the gene expression of collagen BMP2 (bone morphogenetic protein2) and TGFβ (transforming growth factorβ) in human thoracic ligamentum flavum［Method］BMP2 and TGF13 probes were labeled and in situ hybridization results were analyzed by VIDAS system［Result］(1) Under 20 years group:the positive gene expression of TGFβ was evident,but it was negative to BMP2(2) 21 ~40 years group:there were a few positive signal of both BMP2 and TGFβ on the insertion part(3) 41 ~60 years group:there was only few TGFβ positive signal on insertion part,but BMP2 gene expression was relatively high(4) Over 61 years group:there was not TGFβ expression,but BMP2 expression could only be seen on insertion part and junction part,and was low,but the cells were areatus［Conclusion］In normal ligamentum,there is expression of TGFβ gene,but it decreases with age;with age advancing BMP2 emerges and enhances in the insertion part of ligamentum flavum
Key words：Human; Thoracic; Ligamentum; Flavum; BMP2 and TGFβ; Gene expression
在黄韧带中除了弹性纤维以外，主要是Ⅰ型胶原。Ⅰ型胶原抗牵张能力强，在黄韧带中耐受牵拉，并且有一定的预张力，对维持脊柱的稳定有重要作用。Ⅱ型胶原为软骨胶原，在正常的黄韧带中含量极少，报道细胞因子BMP2和TGFβ在动物黄韧带退变过程中表达有一定的变化，本文探讨了BMP2和TGFβ基因表达增龄性变化在人胸椎黄韧带退变过程中的意义。
1 材料和方法
11 实验材料
111 黄韧带标本
21个胸椎黄韧带标本取自椎间盘突出症和椎管狭窄的接受手术病人，正常对照组取自青少年胸椎骨折的病人。术前的影像学检查和术中探查均无韧带骨化，手术取出后立即放入-196 ℃液氮中备用。
112 cDNA探针
BMP2和TGFβ cDNA探针由预防医学院劳动卫生研究所刘秉慈教授提供。
12 实验方法
121 组织切片、固定
组织从液氮中取出后，立即OCT包埋，冰冻切片(切片机以丙酮、乙醇处理)，切片厚度为5 μm。切片置PBS缓冲的4％的多聚甲醛(pH 74)中固定10 min，PBS洗涤2 min×3。37 ℃干燥2 h，密封，置-70 ℃深低温冰箱备用(以上所有试剂均以DEPC处理的双蒸水配制)。
122 探针的标记(地高辛随机引物法标记)〔1〕
123 组织切片上的原位杂交
共分5组：20岁以下组，21~40岁组，41~60岁组和61岁以上组，阴性对照组为不加探针，其余条件与实验组均相同。杂交液中加入地高辛标记的cDNA探针并使其终浓度为2 ng／μl。
13 观察指标
131 原位杂交组织切片显微镜下观察
观察部位，包括黄韧带体部和附着点部、组织形态、细胞分布、杂交信号强度。
132 VIDAS图像分析
14 统计学处理
应用t检验行统计学处理。
2 结果
21 黄韧带Ⅰ、Ⅱ型胶原原位杂交镜下观察
211 20岁以下组原位杂交结果
黄韧带附着点处和体部纤维细胞排列规则，细胞呈梭形细胞数目较多，有明显的TGFβ阳性信号，无BMP2表达信号。
212 21~40岁组原位杂交结果
黄韧带细胞排列尚规则，细胞的数量相对减少，出现轻度纤维化，在黄韧带的附着点处有少量的BMP2和TGFβ阳性表达信号。
213 41~60岁组原位杂交结果
黄韧带体部细胞排列不规则，细胞的数量相对减少，出现明显纤维化，黄韧带体部无明显的阳性表达，黄韧带的附着点处有较弱的的TGFβ阳性表达，但BMP2表达较40岁以下组表达增强。阳性表达细胞分布不均匀。
214 61岁以上组原位杂交结果
黄韧带出现纤维化，未见TGFβ阳性表达信号。黄韧带的附着点处BMP2阳性表达信号增强。
22 VIDAS图像分析结果
221 TGFβ基因表达VIDAS图像分析结果（表1）表1 TGFβ基因表达VIDAS图像分析结果（略）
以上4个观察组与对照组P＜001说明差异呈极显著性，41~60岁和＞61岁之间P＞005，其余各组间P＜005，差异有显著性，说明黄韧带TGFβ基因表达随年龄增长逐渐减弱，41岁后表达变化较少。
222 BMP2基因表达VIDAS图像分析结果(表2)表2 BMP2基因表达VIDAS图像分析结果（略）
以上4个观察组与对照组P＜001说明差异呈极显著性，各组间P＜005，差异有显著性，分析表明随着年龄的增长BMP2基因表达逐渐增强，主要表现在附着点处。
3 讨论
黄韧带退变和骨化的机理尚不明确，黄韧带退变的过程被认为是一个黄韧带呈纤维细胞去分化呈软骨细胞的过程〔2〕。Postacchini〔3〕研究证实，随着年龄的增长，黄韧带发生形态学改变，黄韧带附着点处的纤维软骨带增大。陈雄生等通过动物实验用BMP2诱导黄韧带成纤维细胞分化成软骨细胞，并且细胞外基质的成分发生明显的变化。石健军等研究表明，BMP2能使Ⅰ型胶原明显减少，Ⅱ型胶原增多，但随着时间的延长，Ⅱ型胶原增多，Ⅰ型胶原没有变化，同时发现BMP2诱导的过程，首先是扁平的成纤维细胞分化成纤维软骨细胞，然后再分化成透明软骨细胞。这为黄韧带的软骨内骨化提供了依据。
本研究结果显示：BMP2和TGFβ的表达主要分布在黄韧带的附着点处，Ⅱ型胶原为软骨细胞的基因表型，而Ⅰ型胶原成纤维细胞的基因表型，本研究结果显示，随着年龄的增长，在黄韧带附着点处，BMP2的基因表达增强，TGFβ基因表达减弱，说明软骨细胞的基因表达逐渐活跃，成纤维细胞的基因表达逐渐衰减，BMP2可能促使软骨细胞发生去分化，使黄韧带附着点处发生肥厚、骨化。这可能是黄韧带退变的部分分子机理，但是黄韧带骨化的发生还受其他条件的影响，可能与细胞因子，如BMP2促进成骨的因素有关，但是在人体内黄韧带的退变要经历数十年，与动物模型黄韧带骨化诱导过程只需要几个月仍有很大的差别，说明人体内黄韧带退变和骨化是一个极为复杂的过程，其具体机理尚有待于进一步研究。
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〔1〕 顾树明，胡有谷，郑洪军.人腰椎蛋白多糖核心蛋白的基因表达［J］.中华骨科杂志，1999，19(9)：451453.
〔2〕王哲，王全平，李新奎.胸椎黄韧带骨化的超微结构的观察［J］.脊柱脊髓杂志，1998，8(4)：170171.
〔3〕Postacchini F,Gumina S,Cinotti G,et al.Ligamenta flavum in disc herniation and spinal stenosis［J］.Spine,1994,19(9):917922.
〔4〕石健军，林秋月，王力军.BMP2基因转染对成纤维细胞生长和增殖的影响［J］.中国矫形外科杂志,2003，11(13)：904906.
