哌醋甲酯对大鼠脑缺血性损伤后神经再塑的影响

【摘要】  目的 研究大鼠脑缺血后哌醋甲酯对脑损伤区域及其相关部位神经再塑的影响。方法 线栓法建立大鼠的大脑中动脉缺血模型(MCAO)，术后第3天起，口服灌注哌醋甲酯，采用免疫组织化学方法观察术后第7、14、28天突触素(Synaptophysin，SYN)及突触后致密物质(Postsynaptic density-95，PSD-95)在大鼠皮层缺血灶的内、外、对侧的表达。结果 哌醋甲酯可使SYN在MCAO术后的第14天出现显著增生(P＜0.05)。结论 哌醋甲酯对缺血损伤后的大鼠皮层梗死区的内、外、对侧的神经再塑、突触重建有一定促进作用。

【关键词】  哌醋甲酯；突触素；突触后致密物质；神经再塑

　
　　Abstract： Objective  To observe the effect of Methyphenidate on neuronal plasticity after focal cerebral ischemia in rats. Methods  Unilateral cerebral ischemia was induced in rats by the middle cerebral artery occlusion (MCAO). MPH were given to  rats from the 3th day after MCAO. SYN and PSD-95 were examined by immunohistochmical techniques in the neocortical regions medial and lateral to the infarction as well as in the contralateral neocortex at the 7th 、14th、 28th day after MCAO. Results  SYN demonstrated statistically significant increase in the density of immunoreaction at 14th day compared with sham controls（P＜0.05）. Conclusion  The occurrence of neuronal plasticity after focal cerebral ischemia in rats could be accelerated by Methyphenidate treatment.

　　Key words: Methyphenidate； SYN；PSD-95； neuronal plasticity

    脑损伤后机能恢复与中枢的去甲肾上腺素(noradrenalin，NA)水平有密切关系。右旋苯丙胺(d-amphetamine，D-AMPH)能明显提高损伤周围及对侧皮层神经的芽生、突触再建以及相应的行为恢复［1］。哌醋甲酯(methylphenidate，MPH)与D-AMPH统属一类药物，它能促进中枢和外周神经末梢囊泡释放去甲肾上腺素和多巴胺，并阻断其再摄取，有临床试验显示，由于它具有抗抑郁和改善运动功能的双重作用，而被认为是一个有前途的脑中风的药物［2］，本实验通过制造大鼠的大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion，MCAO)导致皮层区域缺血，以突触素(Synaptophysin，SYN)及突触后致密物质(Postsynaptic density-95，PSD-95)免疫组织化学复合物的表达分布作为突触形成的标志，探讨MPH对神经再塑的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物、分组及给药方法

　　实验动物为第四军医大学动物中心提供，Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量(250±20)g。分为手术用药组(OD)、手术对照组(OC)、假手术用药组(SD)、假手术对照组(SC)，以术后第7、14、28天为观察时间点，每组每个时间点的大鼠数为6只，共72只。采用插线的方法制造MCAO模型。用一细的线栓通过颈总动脉插入颈内动脉，并顺着颈内动脉向颅内推进18～23 mm，即可造成大脑中动脉的完全阻断。假手术组的手术过程除不阻断动脉血流外，余步骤均同手术组。采用口服灌注的方法，按20mg/kg的剂量，对手术给药组及假手术给药组的大鼠口服灌注MPH，1次/日，固定于每日16：00给药，从术后第3天起至各观察时间点。

　　1.2  免疫组织化学法检测SYN及PSD-95

　　各观察时间点的大鼠，用戊巴比妥钠(30 mg/kg，ip)麻醉，40 g/L的多聚甲醛灌注固定，取大脑标本，连续冠状面切片，片厚40μm，0.01 mol/L KPBS清洗10 min×3→浸入含3 mL/L Triton×100的0.01 mol/L KPBS液中30 min→0.01 mol/L KPBS清洗10 min×3→分别入SYN 1∶1000或PSD-95 1∶1000 一抗溶液，4℃下孵育24～48h；取出入0.01 mol/L KPBS清洗10 min×3→分别入相应的二抗溶液(SYN Rabbit A-Rabbit 1∶400；PSD-95 Rabbit A-Goat 1∶200)，室温下孵育2 h→0.01 mol/L KPBS清洗10 min×3→浸入ABC复合物(1∶400 Santa)，室温下孵育2 h，硫酸镍胺加强的DAB蓝色反应法呈色，同时用0.01 mol/L KPBS取代一抗做空白对照。贴片、脱水、透明、中性树胶封片，光镜观察。以Leica Q570C真彩色图象分析仪进行灰度定量分析，在损伤的内、外、对侧分别选5个高倍视野，取测定数值减去背景测定数值的绝对值进行阳性物质密度值的测算。

　　1.3  药品与试剂

　　MPH由苏州第四制药厂生产；小鼠抗SYN单克隆抗体，效价1∶1000购自MAXIM公司；山羊抗PSD-95多克隆抗体效价1∶1000购自SANTA公司。

　　1.4  统计学方法

　　本实验数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，所有数据用均数±标准差(x±s)表示，两样本比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  MPH对SYN免疫反应产物的影响

    在正常的新皮层，SYN呈细颗粒点状弥散分布在各层(图1，见封3)，MPH使之在MCAO术后的第14天出现显著增生(P＜0.01)；在第28天手术给药组的灰度较其他各组均有所增强(P＜0.05)。而损伤的内、外、对侧之间，在同组、同时间点其反应无明显不同(表1)。表1  MPH对大鼠皮层SYN免疫反应复合物灰度值的影响(略)

　　2.2  MPH对PSD-95免疫反应产物的影响

    PSD-95在正常的新皮层，其免疫反应阳性产物主要呈层状分布，神经细胞胞体、树突着色，分别呈圆点状、锥形和纤维丝状(图2，见封3)。在分子层，少量胞体阳性，树突较短，无明显方向性，杂乱；在外颗粒细胞层及外锥体细胞层阳性细胞较密集，着色深，有较少的纤维状阳性树突垂直于脑表面平行穿过；在内颗粒层，从内锥体细胞层发出的纤维状树突，表达呈明显的方向性，垂直于脑表面，平行排列，期间散在胞体阳性；在锥体细胞层较多胞体集中分布，见大量胞体阳性的锥体细胞排列整齐，大锥体细胞为多，可见丝状树突从本层向皮层表面发出(图3，见封3)。

    手术给药组与手术对照组相比在各时间点其灰度值变化无统计学意义(P＞0.05)，但是在镜下所见手术给药组的细胞及树突较有序；假手术组及假手术给药组与正常大鼠皮层在形态与灰度值上基本相同(表2)。表2  MPH对大鼠皮层PSD-95免疫反应复合物灰度值的影响(略)

    临床卒中患者的肢体偏瘫，经过综合等部分患者可以逐渐部分甚至完全恢复的现象提示，中枢神经系统出现了某种代偿机制。当代神经病学家认为大脑功能可以通过学习和训练以及药物完成因病损而丧失的功能，但脑必须具有重新获得的形态学基础。

    脑缺血后单胺类递质在脑组织病理、生理改变中的作用比较复杂，去甲肾上腺素能药物促进神经功能恢复的机制尚不完全清楚，推测可能与以下机制有关：促进了神经解剖环路的再建［3］；可以使易损神经元吸收更多的营养物质，从而挽救了这些频死的神经元，减少了神经元的死亡；刺激突触前释放儿茶酚胺从而解除了抑制性环路的抑制作用，引起广泛的易化作用增强；与解除损伤后广泛的代谢性抑制有关；替代通路被激活，替代并恢复失去的行为功能等，但其确切的机理还有待进一步的研究证实。
   
　　SYN又称P38，是一种分子量为38kD的酸性钙结合糖蛋白，它作为一种内在膜蛋白，几乎存在于所有神经终末的突触前成份内，并选择性地分布于小圆形或扁形(Ⅰ、Ⅱ型)突触囊泡膜的胞质面。SYN作为突触囊泡的一种特异性标志蛋白，其密度可间接反映突触的数量、分布和密度［4］与神经再塑有关。通过检测SYN的免疫反应性，结合图像分析，可以估算突触发生，借以反映神经发育及大脑对损伤的反应［5］。本实验结果显示，于MCAO后的第14天SYN在手术给药组出现显著增生，标志着新的突触联结开始出现。在第28天手术给药组的灰度较其他各组均有所增强，说明在MPH的作用下损伤周围及对侧神经的芽生和突触联结有明显增强，这是否预示与皮层相对应的残肢功能恢复有了一定的组织结构基础，有待在今后的研究中加以证实。

    PSD是突触后膜内侧胞浆面的一层均质性的致密物质，其成份主要是微管蛋白、肌动蛋白、神经丝蛋白、Fodrin(钙调蛋白的一种主要成分)，PSD-95是组成兴奋性突触的突触后致密物质中的一个主要蛋白，属膜相关鸟苷酸样激酶(membrane-associated guanylate kinases，MAGUK)蛋白家族中的一员，存在于所有皮层结构中，包括小脑、大脑皮层和海马等，其他脑组织，如纹状体、丘脑同样有PSD-95的存在。在大脑皮层PSD-95分布在神经元胞体和神经树突的近端，在感觉运动皮层的第Ⅴ层的锥体细胞特别明显［6］。神经递质的受体在突触后位点的准确簇集和被正确激活，是功能性突触形成时的基本需求。RAO等［6］的研究显示，PSD-95与NMDA 受体在突触后位点的准确蔟集和精确定位有一定关系。PSD-95和GKAP(与PSD-95相关的蛋白)首先形成一个突触后骨架，随后谷氨酸受体亚单位附着于骨架上，共同调节突触的活动。此外，PSD-95对K+通道的簇集和定位［7］以及信号传导均有特异性的调节作用［8］。PSD-95作为突触后膜的代表物质之一，在本实验中其免疫复合物灰度的变化与是否用药无关，却与手术与否有关，该结果与R Paul［3］等的结论相符。推测在局灶性脑缺血性损伤之后，大量的神经元死亡，将导致区域性的皮层去神经状态，这种状态可作为一种刺激，使那些未损伤的神经元发芽并建立新的突触联接，尤其是在脑损伤周围与损伤相对应的对侧皮质，这是人体对损伤而产生的一种代偿机制。除灰度变化之外，PSD-95在细胞及树突排列更加有序，可能是由于PSD-95的免疫复合物有细胞与轴突两种表现形式，这种有序或许是恢复的征象之一；或许与不可知的机理及样本数量所限有关，有待进一步探讨。

    本实验认为，缺血性脑损伤可以作为一种刺激，使损伤脑组织周围及对侧那些未损伤的神经元发芽并建立新的突触联接，而MPH能够明显促进缺血损伤后的大鼠损伤皮层的神经再塑，由于肢体的功能恢复是以组织结构的改变为基础，本实验从动物的基础组织学变化上，为MPH今后治疗脑卒中提供了部分实验室研究依据。

【】
  　　［1］Stroemer RP，Thomas A，Kent MD，et al.Neocortical Neural sprouting，synaptogenesis，and bebavioral recovery after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1995，26(11)：2135-2143.

　　［2］Grade-C，Redford-B，Chrostowski-J，et al. Methylphenidate in early poststroke recovery：a double-blind，piacebo-controlled study［J］.Arch Phys Med Rehabil，1998，79(9)：1047-1050.

　　［3］R Paul stroemer Pho，Thomas A，Kent MD，et al.Enhanced neocoritical neural sprouting，synaptogenesis，and behavioral recovery with D-Amphetamine therapy after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1998，29：2381-2395.

　　［4］Wiedenmann B，Franke W.Identification and locolization of synaptophysin，an integral membrane glycoprotein of Mr 38000 characteristic of presynaptic vesicles［J］. Cell，1985，41(3)：1017-1028.

　　［5］Eastwood SL，Burnet PWJ，Masliah E.Synaptophysin gene expression in human brain：a quantitative in sitn hybridization and immunocytochemical study［J］.Neuroscience，1994，59(4)：881-892.

　　［6］Patrick Bassand，Anne Bernard，Amina Rafiki，et al. Differential interaction of the tSXV motifs of the NR1 and NR2 NMDA receptor subunits with PSD-95 and SAP97［J］.Eur J Neurosci，1999，11：2031-2043.

　　［7］Rao-A，Kim-E，Sheng-M，et al.Heterogeneity in the molecular composition of excitatory postsynaptic sites during development of hippocampal neurons in culture［J］.Neuroscience，1998，18(4)：1217-1229.

　　［8］Fujita A，Kurachi Y.SAP family protein［J］. Biochem Biophys Res Comma，2000，269(1)：1-6.