mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

【摘要】  目的： 构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法： 利用PCR方法扩增mGITRL基因，克隆至pIRES2-eGFP载体，选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞，通过G418筛选，获得稳定表达细胞株。结果： 构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，基因测序与GenBank中发表的序列完全一致，体外转染Lewis细胞，经G418筛选，体外传代30代以上，RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论： 成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，并在小鼠Lewis细胞中稳定表达，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。

【关键词】  GITRL； 细胞转染； 肿瘤

　　［Abstract］  Objective: To construct eukaryotic expression vector containing mGITRL gene pIRES2-eGFP/mGITRL and transfect it into Lewis cell. Methods： The mGITRL gene was amplified from intermediate vector PMD18-T/mGITRL by PCR and inserted into pIRES2-eGFP vector, and the sequence of DNA was analyzed. The mGITRL gene was transfected into Lewis cell by electroporation and the positive clone was selected by G418. Results： Expression plasmid pIRES2-eGFP/mGITRL was successfully constructed, sharing 100% homology with the sequence of mRNA for mGITRL in GenBank. mGITRL gene and the protein could be detected by RT-PCR and FCM in the transfected Lewis cell.  Conclusion： pIRES2-eGFP/mGITRL vector has been constructed successfully and was expressed stably in Lewis cell, which brought a foundation for further researching on its biological function.

　　［Key words］  glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand； cell transfection； tumor

　　肿瘤严重危害人类健康，免疫已成为肿瘤治疗的重要手段。研究发现调节性T细胞抑制效应性T细胞，在肿瘤的发生中发挥重要的作用，体内清除调节性T细胞则有利于抗肿瘤免疫应答［1］。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的重要表面标志，其配体（GITR ligand, GITRL）具有解除Treg免疫抑制功能的作用［2］。本研究构建pIRES2-eGFP/mGITRL真核表达质粒，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
 
　　RPMI1640（Gibco公司），新生小牛血清（兰州民海生物有限公司），PE标记anti-mGITRL（eBioscience 公司），Trizol及逆转录试剂盒（Invitrogene公司），DNA聚合酶，dNTP，EcoRⅠ及SalⅠ核酸内切酶，DL2 000，λ-EcoT14Ⅰdigest DNA相对分子质量标准（Takara Biotec公司），PCR产物纯化试剂盒（Macherey-Nagel公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），大肠杆菌DH5α，Lewis细胞株以及载体pIRES2-eGFP为本室保存。
 
　　1.2  引物的设计与合成
 
　　根据基因库中小鼠GITRL基因ORF序列，通过Primer Premier5.0软件设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-GAGAATTCATGGAGGAAATGCCTTGAG-3′,下游引物：5′-CCCGTCGACCTAAGAGATGAATGGTAGATC-3′，引物中增加了EcoRⅠ（GAATTC）及SalⅠ（GTCGAC）2个酶切位点。

　　1.3  pIRES2-EGFP/mGITRL 克隆及鉴定
 
　　以mGITRL-TA质粒［3］（本室保存）为模板，通过PCR扩增获得mGITRL基因。PCR反应体系包括2.5 μl 10×缓冲液，2 μl 2.5 mmol/L MgCl2，2.5  μl 2 mmol/L dNTP，2 μl模板，0.25 μl Ex Taq酶（5 U/μl），1 μl上游引物及下游引物，13.75 μl H2O，总体积25 μl。PCR反应条件为94℃预变性2.5 min,然后94℃变性30 s，62 ℃退火30 s,72℃延伸1 min，共进行35个循环，再72℃延伸5 min。PCR扩增产物通过Macherey-Nagel公司的Nucleospin试剂盒进行纯化。用EcoRⅠ和SalⅠ分别对上述纯化产物及pIRES2-eGFP进行双酶切，分别进行胶回收，回收的目的片段和载体在室温下利用T4DNA连接酶连接1 h，连接产物转化DH5α宿主菌后，接种含50 μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落，转种LB培养基（含50 μg/ml卡那霉素），抽提质粒，酶切，电泳鉴定。
 
　　将经过鉴定的阳性重组质粒，通过通用引物进行双向反应测序，将测定的核苷酸序列与基因库中原有的序列比较分析。
 
　　将测序正确的pIRES2-eGFP/mGITRL质粒的DH5α菌株大量扩增，并严格按照Axygen试剂盒里说明书抽提质粒，同时抽提pIRES2-eGFP质粒以作为阴性对照。

　　1.4  Lewis细胞转染及阳性克隆的筛选
 
　　采用电穿孔法将pIRES2-eGFP/mGITRL及pIRES2-eGFP(对照组质粒)分别转染Lewis细胞。状态良好的Lewis细胞4.0×106，加入质粒15 μg，无血清1640培养基调整体积为300 μl并接种于电转杯中，冰上放置5 min后电转仪电击（0.22 kV，960 μf），转染后细胞接种于6孔板中培养，48 h后加入800 μg/ml G418,每3～5天更换培养液。培养15～20 d后,将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中。将单个克隆细胞通过流式细胞术鉴定EGFP的表达，其中阳性细胞孔细胞扩大培养，以终浓度300 μg/ml G418维持其生长，体外连续传代30代以上，冻存，并将这两种转染阳性细胞分别命名为GITRL-Lewis和pIRES-Lewis。

　　1.5  转染细胞的鉴定
 
　　将1×106 GITRL-Lewis，pIRES-Lewis以及Lewis细胞分别加入1 ml Trizol，提取总RNA，根据逆转录试剂盒提供的方法将总RNA逆转录成cDNA，再用特异的mGITRL引物，通过PCR（条件同上）验证mGITRL的表达。同时将1×106转染细胞分别加入PE标记抗mGITRL抗体和PE同型对照抗体1 μl，避光冰浴30 min，通过流式细胞仪检测EGFP及mGITRL的表达情况。

　　2  结果
 
　　2.1  GITRL基因PCR扩增结果
 
　　采用特异的mGITRL引物，通过PCR扩增获得目的基因，其长度与目的片段（519 bp）基本一致（图1）。
 
　　1： DNA标准（DL 2 000）；2：PCR扩增产物

　　图1  GITRL基因PCR扩增结果（略）

　　Fig 1  PCR products of GITRL gene
 

　　2.2  pIRES2-eGFP/mGITRL重组质粒的筛选和鉴定
 
　　挑选阳性克隆，通过酶切鉴定，条带分别为5 300 bp和519 bp左右，结果见图2。pIRES2-eGFP/mGITRL重组质粒经Invitrogene公司测序，结果与基因库中原有序列（AY359852.1）比较，两者编码区序列完全一致。
 
　　1：λ-EcoT14Ⅰdigest标准；2：pIRES2-eGFP单酶切质粒（EcoRⅠ）；3：阳性克隆单酶切质粒（EcoRⅠ）；4：阳性克隆双酶切质粒（EcoRⅠ和SalⅠ）；5：DNA标准（DL2000）

　　图2  mGITRL基因重组质粒的鉴定（略）

　　Fig 2  Identification of pIRES2-eGFP/mGITRL plasmid

　　2.3  转染细胞的鉴定
 
　　用pIRES2-eGFP/mGITRL及pIRES2-eGFP（对照）分别转染Lewis细胞。显微镜下显示GITRL-Lewis，pIRES-Lewis细胞形态与未转染的Lewis细胞无明显差别。RT-PCR检测Lewis，PIRES-Lewis，GITRL-Lewis细胞mGITRL基因，结果显示只有GITRL-Lewis细胞表达mGITRL，而未转染的Lewis及PIRES-Lewis细胞未检测出mGITRL mRNA的表达（图3）。
 
　　1：Lewis细胞；2：pIRES-Lewis细胞；3：GITRL-Lewis细胞

　　图3  RT-PCR检测细胞表达mGITRL结果（略）

　　Fig 3  Expression of mouse GITRL mRNA in Lewis　transfected with mGITRL gene
   
　　流式细胞仪检测结果显示GITRL-Lewis及pIRES-Lewis细胞均表达EGFP（图4），其中GITRL-Lewis细胞表达mGITRL（图5）。
 
　　3  讨论
 
　　肿瘤细胞作为一种机体“非我”成分，能够逃逸机体的免疫监视。实验研究表明肿瘤在发生过程中不能被有效抑制和清除，主要与机体的免疫功能低下或被抑制有关，其中 Treg细胞发挥重要的作用［4-7］。近年来发现在肺癌、胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌等患者外周血和肿瘤局部浸润淋巴细胞中CD4+CD25+ Treg细胞明显增加，并且Treg细胞能够抑制宿主的抗瘤免疫应答［8］。

　　a：GITRL-Lewis细胞；b：pIRES-Lewis细胞

　　图4  流式细胞仪分析EGFP表达情况（略）

　　Fig 4  Analysis of EGFP expression by FCM

　　图5  流式细胞仪分析GITRL-Lewis细胞的GITRL的表达情况（略）

　　Fig 5  Analysis of GITRL expression in GITRL-Lewis　cell by FCM
     
　　GITR是调节性T细胞上的一个重要标志。天然CD4+CD25+Treg细胞组成性高表达GITR，而其他T细胞活化后诱导性表达GITR。McHugh等［9］在研究CD4+CD25+Treg细胞介导免疫抑制的分子通路时发现，GITR的拮抗性抗体在体外可以阻断CD4+CD25+Treg细胞介导的免疫抑制功能，而对CD4+CD25-T细胞没有作用。Shimizu等［10］通过体内试验进一步证实GITR的拮抗性抗体能够阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制作用进而诱导器官特异性自身免疫，而GITR抗体对效应性CD4+T细胞和CD8+T细胞具有明显的活化作用。Tone等［11］研究发现GITRL与CD4+CD25+Treg细胞表面GITR结合后具有阻断CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制功能的作用，并且这种作用与活化NF-κB有关；而对初始T细胞及Th1，Th2细胞克隆，GITRL与这些细胞表面的GITR的结合可提供协同刺激信号，促进其增殖。在最近的一项研究中，Calmels等［2］研究结果提示GITRL在肿瘤组织的表达可通过减少肿瘤组织中浸润的Treg细胞、增加效应性T细胞数目，从而达到抑制肿瘤生长的作用。
本研究旨在通过基因转染的方法在肿瘤细胞表达GITRL。成功构建了mGITRL基因的重组真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，基因测序与基因库中发表的序列完全一致，体外转染Lewis细胞，经G418筛选，获得稳定表达的单个克隆细胞株，RT-PCR检测出该细胞株表达mGITRL，流式细胞仪检测该细胞株表达EGFP和mGITRL。提示已经成功在小鼠肺癌细胞株Lewis细胞稳定表达mGITRL，为今后进一步研究GITRL的生物学功能及与CD4+CD25+Treg细胞相互作用提供了实验基础。

【】
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