VEGF在大鼠缺血再灌注损伤肝组织中的表达及其意义

【摘要】  目的： 探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在缺血再灌注损伤肝组织中的表达及意义。方法： 利用雄性SD大鼠建立部分肝血流阻断动物模型，肝血流阻断90 min后恢复血流灌注，再灌注后1,6 h处死大鼠收集标本。分别采用全自动生化分析仪、HE 染色，比色法、ELISA法测定血清转氨酶(ALT,AST)，肝组织病理改变,肝组织髓过氧化物酶（MPO）的活性以及VEGF蛋白的含量。结果： 与假手术组相比，缺血再灌注组（I/R组）缺血肝脏MPO活性，肝组织内VEGF蛋白的含量以及ALT，AST在再灌注1 h即升高，且缺血再灌注6 h时较1 h明显升高；缺血肝脏病理切片可见大量炎症细胞浸润，6 h炎症反应更为剧烈，部分肝细胞呈点状坏死。结论： VEGF蛋白表达的上调可能参与了大鼠肝脏缺血再灌注过程中肝脏的损伤。

【关键词】  肝脏； 缺血； 再灌注损伤； 血管内皮生长因子

　　［Abstract］  Objective: To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in the liver ischemia/reperfusion injury and significance.Methods： The male SD rats were used to establish partial hepatic vascular exclusion animal model. After ischemia for 90 min，SD rats liver were reperfused，and then liver specimens were collected at 1 h and 6 h after reperfusion respectively. Routine assays were performed for testing the levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase（AST）and the activity of hepatic myeloperoxidase(MPO).The changes of VEGF protein in ischemic liver lobes were determined by ELISA. The liver tissues pathological changes were evaluated in hematoxylin and eosin(HE) stained. Results： After 90 min of partial liver ischemia,the AST,ALT level in I/R group was significantly increased as compared with the sham-operated(SH) group, and AST,ALT level at the 6 h reperfusion was markly higher than that at the 1 h reperfusion.The expression of VEGF protein and the MPO activity in hepatic tissues were remarkably up-regulated in I/R group than in the SH group at the time point of 1 h and 6 h reperfusion.They were higher at 6 h reperfusion than that at 1 h. For HE staining, the infiltration of many inflammatory cells was observed in liver tissue and became much severer at 6 h posT-reperfusion liver tissue.  Conclusion： The up-regulation of VEGF protein in hepatic I/R injury process might be involved in the process of liver injury.

　　［Key words］  liver； ischemia； reperfusion injury； vascular endothelial growth factor

　　缺血再灌注损伤是肝移植、复杂肝切除术中常常涉及的共同病理过程，多种细胞因子参与并介导了肝缺血再灌注损伤过程中的各个环节。近年来,国外许多学者研究发现血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与缺血再灌注损伤密切相关［1,2］。血管内皮生长因子又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，它是一种二聚糖，蛋白相对分子质量为34～45 kD,由两个相同的亚基组成，是内皮细胞产生的特异性促有丝分裂原,具有促进内皮细胞增生、迁移，增加血管通透性和加速新血管形成的作用。本文通过观察大鼠肝缺血再灌注模型中肝组织内VEGF蛋白的表达，探讨其在肝缺血再灌注损伤中的作用。
 
　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂
 
　　大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；髓过氧化物酶（MPO）测试盒购自南京建成生物工程研究所。
 
　　1.2  动物分组及模型建立
 
　　健康雄性SD大鼠，体质量（300±20）g，江苏大学医学院实验动物中心提供。将SD大鼠随机分成假手术组、肝缺血再灌注1,6 h模型组，每组6只。手术前12 h动物开始禁食而自由饮水，腹腔内注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，常规消毒、铺巾，上腹正中切口逐层进腹，分离肝门，无损伤动脉夹阻断肝脏中叶、左叶血供，90 min后恢复缺血肝叶血供，建立70％肝脏缺血再灌注损伤模型，假手术组仅行麻醉、开腹、不阻断血流。各组在相应时间点处死大鼠，留取门静脉血清和缺血区肝脏组织。
 
　　1.3  肝脏VEGF,MPO及肝功能检测
 
　　肝脏VEGF蛋白含量采用大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒进行检测，肝组织中的MPO采用髓过氧化物酶测试盒进行检测，操作按试剂盒说明进行。血清丙氨酸氨基转换酶(ALT),天冬氨酸氨基转换酶(AST)水平应用Olympus Au2700全自动生化分析仪(日本)进行分析,判定肝脏功能改变情况。
 
　　1.4  肝脏组织学检查
 
　　取缺血肝组织经10%甲醛固定、石蜡包埋后常规切片和HE染色，显微镜下观察组织病理变化。
 
　　1.5  统计学分析
    
　　用SPSS 12.0 软件进行分析，定量资料用x±s表示，采用方差分析、t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
 

　　2.1  血清酶学变化
 
　　肝缺血再灌注后门静脉血清ALT,AST浓度升高,再灌注1,6 h，缺血再灌注组较假手术组高(P<0.01)，且6 h明显高于1 h(P<0.01)。见表1。

　　表1  各组大鼠血清ALT,AST,肝组织VEGF水平以及MPO活性（略）

　　Tab 1  Levels of serum ALT,AST，hepatic VEGF and the MPO activity in hepatic tissues

　　与假手术组比较, *：P<0.01；与缺血再灌注1 h比较, △：P<0.01
 
　　2.2  肝组织病检查
 
　　假手术组肝细胞、内皮细胞和肝窦在各手术时段均未见明显异常。在缺血再灌注组,再灌注后1 h即可见肝细胞、内皮细胞水肿；再灌注6 h内皮细胞水肿、空泡变性及坏死明显,中性粒细胞在肝窦内大量积聚,并黏附于内皮细胞,部分中性粒细胞跨越内皮细胞,浸润肝细胞,并且在肝缺血再灌注组的肝脏中,窦状隙后小静脉与肝窦一样可见到白细胞的堆积。见图1。
 
　　2.3  肝脏VEGF蛋白表达及MPO活性
 
　　本研究结果显示,假手术组各时点VEGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)；缺血再灌注组1 h后VEGF蛋白表达增加，6 h时较1 h时明显增加(P<0.01)。再灌注1,6 h，缺血再灌注组较假手术组升高(P<0.01)，且缺血再灌注6 h明显高于1 h(P<0.01)。见表1。
 
　　3  讨论
 
　　国外研究发现肝脏损伤后局部的VEGF主要来源于浸润的炎症细胞，尤其是CD11b＋细胞［3］，研究人员认为局部VEGF的高表达可以增加血管通透性，活化内皮细胞，促进黏附分子和化学增活素的表达，从而加重组织损伤［4］。肝脏缺血再灌注早、中期损伤通常发生在再灌注之后0～6 h，各种炎症因子显著升高,肝功能损害较为明显［5,6］。本实验中以再灌注后1，6 h 作为观察时间点,可确切反映大鼠肝脏缺血再灌注后的肝功能状况以及肝内VEGF的表达情况。
 
　　本研究结果显示,缺血再灌注后1 h时即可发现肝组织VEGF表达增加，6 h时明显增加。而且在缺血再灌注组大鼠肝组织发生了显著的病理改变,大量炎症细胞浸润，6 h炎症反应更为剧烈，部分肝细胞呈点状坏死，肝组织中的髓过氧化物酶含量随再灌注时间延长逐渐增加，ALT，AST水平也升高,表明VEGF与肝缺血再灌注损伤有关，这与国外的有关研究报道相符［1-3］。髓过氧化物酶是存在于中性粒细胞内的一种耐高温酶,它是反映中性粒细胞在组织中浸润程度的指标。肝脏缺血再灌注后其含量增加，表示肝组织中性粒细胞浸润程度越严重，而且肝组织病理发生了显著改变，大量炎症细胞浸润，这些都表明其损伤机制可能与诱导白细胞趋化，增加中性粒细胞浸润有关。众所周知，肝缺血再灌注损伤与中性粒细胞的浸润和活化有关。活化中性粒细胞与内皮细胞黏附后增高肝窦内阻力，从而引起肝脏组织发生微循环障碍。而且黏附在内皮细胞上的中性粒细胞通过释放蛋白酶损伤内皮细胞及肝实质细胞［7］，活化后的中性粒细胞在细胞膜上NADPH 氧化酶作用下释放大量的氧自由基，从而加重组织细胞的损伤。
 
　　本实验提示，VEGF蛋白表达的上调可能参与了肝缺血再灌注损伤的病理过程，但是在肝脏缺血再灌注损伤中VEGF是如何发挥其作用，具体机制尚需进一步研究。
 
　　(本文图1见彩色插图）（略）

【】
  　　［1］ Tsurui Y，Sho M，Kuzumoto Y，et al. Dual role of vascular endothelial growth factor in hepatic ischemia-reperfusion injury［J］.Transplantation, 2005,79(9):1110-1115.

　　［2］ Tsuchihashi S，Ke B，Kaldas F，et al. Vascular endothelial growth factor antagonist modulates leukocyte trafficking and protects mouse livers against ischemia/reperfusion injury［J］. Am J Pathol，2006，168(2): 695-705.

　　［3］ Boros P，Tarcsafalvi A，Wang L，et al.Intrahepatic expression and release of vascular endothelial growth factor following orthotopic liver transplantation in the rat［J］.Transplantation，2001，72(5):805-811.

　　［4］ Roberts WG，Palade GE. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor［J］.J Cell Sci,1995,108(6):2369-2379.

　　［5］ Fondevila C，Busuttil RW，Kupiec-Weglinski JW. Hepatic ischemia/reperfusion injury-a fresh look［J］.Exp Mol Pathol,2003, 74(2): 86-93.

　　［6］ Serracino-Inglott F,Habib NA,Mathie RT. Hepatic ischemia-reperfusion injury［J］.Am J Surg, 2001, 181(2): 160-166.

　　［7］ Cutrn JC，Perrelli MG，Cavalieri B，et al. Microvascular dysfunction induced by reperfusion injury and protective effect of ischemic preconditioning［J］.Free Radic Bio Med，2002，33(9)：1200-1208.