钛铌锆β钛合金生物相容性的体外实验研究
作者：贾庆卫，宁聪琴，丁冬雁，汤亭亭，严孟宁, 周新社，戴尅戎
【摘要】 ［目的］通过体外实验对自行研发的低弹性模量、高强度新型β型钛合金人工关节假体材料生物相容性进行评价。［方法］（1）采用L-929细胞（小鼠成纤维细胞）对合金进行细胞毒性试验，将细胞相对增殖率（RGR）转换成6级材料毒性进行评级。（2）将1 μm左右的钛铌锆合金（Ti-Nb-Zr）颗粒与J774A.1巨噬细胞体外共同培养24～48 h后，采用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞变化、RT-PCR方法测定IL-6和TNF-α表达、ELISA法测定细胞培养上清TNF-α等方法对Ti-Nb-Zr的生物相容性进行评价，并与传统的人工关节假体材料进行比较。［结果］Ti-Nb-Zr的细胞毒性为0级。吞噬了Ti-Nb-Zr颗粒的J774A.1巨噬细胞形态改变明显轻于钴铬钼颗粒组和钛铝钒颗粒组。巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti-Nb-Zr颗粒共同培养48 h后都有IL-6和TNF-α mRNA表达的增加，钴铬钼颗粒和钛铝钒颗粒引起增加更加明显。ELISA方法测定显示：巨噬细胞吞噬Ti-Nb-Zr颗粒48 h后分泌TNF-α的量明显低于钛铝钒和钴铬钼（P<0.05）。［结论］低弹性模量Ti-Nb-Zr 钛合金具有优良的体外组织相容性，是一种有前途的骨科内植物材料。
【关键词】 钛铌锆； 生物相容性材料； 体外研究
［Method］（1）the cell toxicity of Ti-Nb-Zr was evaluated using L-929 cell line's relative growth rate (RGR) which was transformed into 6 toxicity ranks in according with the national standard;（2）the J774A.1macrophages cultured with Ti-Nb-Zr particles whose diameter was about 1 μm for 24-48 hours were observed using inverted phase contrast microscopy and transmission electron microscopy. Expression of IL-6 and TNF-αmRNA in these cells were measured using RT-PCR technique. The TNF-α in the supernatant was also measured using ELISA method. All the results were compared with the traditional orthopedic implants metal materials such as Ti-6Al-4V and Co-Gr-Mo.
［Result］The cell toxicity of Ti-Nb-Zr was ranked zero degree. The particles could be seen in the macrophages under the light microscopy. Ti-Nb-Zr particles made the J774.A1 macrophages less configurative changes than Ti-6Al-4V and Co-Gr-Mo did.Expressions of IL-6 and TNF-αmRNA in J774.A1 cell were increased after stimulation for 48 hours by all kinds of metallic materials. The TNF-α in the supernatants of Ti-Nb-Zr group were less than that of the Ti-6Al-4V and Co-Gr-Mo groups (P<0.05).
［Conclusion］The Ti-Nb-Zr beta titanium alloys developed in the author's lab have lower modulus and good biocompatibility. It is a promising material for orthopedic implants.
Key words：titanium-niobium-zirconium; biocompatible materials; in vitro
目前使用的人工关节假体和内固定大多以高弹性模量金属材料制造，置入体内易产生“应力遮挡”效应，导致植入物周围骨吸收，这是引发假体松动和内固定节段骨质疏松的主要力学原因［1、2］。以Ti-6Al-4V为代表的钛合金弹性模量低于钴铬钼合金和不锈钢，但是仍然偏高，且含有V和Al 两种被认为是对生物体有毒的元素，因此研制生物相容性更好的低弹性模量材料成为骨科人工关节材料的方向。β型钛合金以其生物相容性优良的合金元素构成和独特的晶体结构满足了人们对生物材料生物相容性和低弹性模量力学相容性的要求，同时又具有足够的力学强度，成为骨科生物材料研究的热点［3］。
作者通过向钛基中加入相容性更好的合金元素Nb、Zr等元素，在国内首次成功研制钛铌锆β型钛合金（Ti-Nb-Zr）。Ti-Nb-Zr的抗拉强度：706～874 MPa，弹性模量：59～66G Pa，延伸率：5.4％～20%。达到了低弹、高强的设计目标［4］。本研究通过多种体外实验的方法进一步对其生物相容性进行评价，与传统的人工关节假体和内固定材料进行比较，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 钛铌锆β型钛合金（Ti-Nb-Zr）的研制
将合金元素（钛、铌、锆）按不同比例混合，在真空自耗电弧炉中熔炼、浇注成圆棒（铸造态）。取铸造态材料在高温区锻造，可得到锻造变形合金（图1）。
1.2 金属材料颗粒的制造与颗粒混悬液的制备
采用作者实验室研发的设备，制备Ti-Nb-Zr颗粒供实验使用［5］。颗粒平均直径（Dv90）为1.001 μm，99.93%的颗粒在0.3～1.2 μm之间。
1.3 Ti-Nb-Zr的细胞毒性试验
使用L-929细胞（小鼠成纤维细胞），实验细胞为传代48～72 h生长旺盛细胞。细胞培养基为含10%（V/V）小牛血清的Eagle′s MEM加入中。将Ti-Nb-Zr薄片（厚度≤1 mm）用肥皂水清洗，重蒸馏水洗涤，滤纸吸干，医用不锈钢丝悬吊，高压蒸汽灭菌备用。
根据国家技术标准GB/T16175-1996对合金进行细胞毒性试验（测试温度为24℃，湿度为58%）。将同一时间组内光吸收值作方差分析并进行均数间两两比较，通过光吸收值绘制细胞增殖曲线细胞相对增殖率（RGR），并将其转换成6级材料毒性评级（表1）。表1 GB/T16175-1996中材料毒性分级标准
1.4 巨噬细胞培养与吞噬实验
J774A.1巨噬细胞株来源于BALB/c小鼠网状细胞肉瘤，由American Type Culture Collection Co.（Rockville,MD,USA）提供，培养在含10%小牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期的细胞，以2×105/ml接种于6孔板中，培养4～6 h后，分别加入钴铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒颗粒混悬液和Ti-Nb-Zr颗粒混悬液（107个/孔），另外分别于35 mm培养皿中按上述方法接种细胞，同时设置不加任何刺激物的对照孔。刺激后24 h用2.5%戊二醛溶液固定，进行倒置相差显微镜观察并摄像。
1.5 培养巨噬细胞透射电镜观察
J774A.1巨噬细胞分别加入铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒合金颗粒混悬液和Ti-Nb-Zr颗粒混悬液（107/孔）作用24 h用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子将全部细胞从皿底上轻轻刮下，收集在离心管中2 000 r/min离心20 min，弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进行漂洗、1%锇酸后固定15 min、漂洗、脱水、浸透，将样品从棉花纸内取出进行包埋，60℃烘箱内48 h，超薄切片，透射电镜观察并摄像。
1.6 巨噬细胞RT-PCR测定IL-6和TNF-α表达
J774A.1巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti-Nb-Zr合金颗粒分别培养24、48 h后收集细胞用于抽提RNA。设置不加颗粒的空白对照组。
根据GeneBank中 IL-6，TNF-αcDNA的序列设计引物。
IL-6上游序列： 5'-TTCTTGGGACTGATGCTG-3' 。
下游序列： 5'-CTGGTCTTGTCTTTCTTGTT-3'。产物大小1 087 bp。
TNF-α上游序列： 5'- GGGCTTCCAGAACTCCAG-3'。
下游序列： 5'-CAATGACTCCAAAGTAGACC-3' 产物大小为 635 bp。
同时以鼠GAPDH为对照，
引物的上游序列： 5'-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3'。
下游序列：5'-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3'，产物大小为 660 bp。
采用异硫氰酸胍－酸性一步法提取细胞总RNA进行RT-PCR。PCR扩增条件如下：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 90 s，35个循环；72℃ 延伸 10 min。
1.7 巨噬细胞培养上清的TNF-α测定
J774A.1巨噬细胞分别加入铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒合金颗粒混悬液和Ti-Nb-Zr颗粒混悬液（107/孔）作用24h和48h时分别抽取细胞培养上清液，-75℃冻存。TNF-α的测定用ELISA试剂盒(购自BioSource U.S.A Headquarters)。TNF-α测定的按操作程序进行。
1.8 统计学分析
所有测量结果经SAS 6.12软件处理。组内各参数之间的比较用方差分析，两两比较用q检验，以P<0.05表示差异有显著意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。
2 结果与分析
2.1 细胞毒性试验
测试结果（表2）。试验结果表明该合金的细胞毒性为0级，表明此合金具有很好的细胞相容性。表2 Ti-Nb-Zr合金的细胞毒性试验结果
2.2 巨噬细胞培养与吞噬实验
J774A.1巨噬细胞经合适的条件培养24 h后细胞生长旺盛，吞噬活性较强。倒置相差显微镜下细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无吞噬小体（图2、3）。
在与1 μm左右的钛铝钒颗粒共同培养24 h后，镜下细胞形态发生明显变化。细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，胞浆内有被吞噬的颗粒影像（图4、5）。
与钴铬钼颗粒共同培养的细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂。仍可见胞浆内被吞噬的颗粒影像（图6、7）。
与Ti-Nb-Zr颗粒作用后的细胞胞浆内可以见到被吞噬的颗粒，但细胞形态与阴性对照组相似，（图8、9）
与Ti-Nb-Zr颗粒作用后的细胞胞浆内可以见到被吞噬的颗粒，但细胞形态与阴性对照组相似。
2.3 培养巨噬细胞透射电镜观察
正常的J774A.1巨噬细胞透射电镜下为圆形或椭圆形，细胞体积较大直径约10 μm，细胞周边有绒毛样突起。胞浆丰富，可以见到各种细胞器，一般没有大量的吞噬体。核染色质分布均匀，2～3个核仁（图10、11）。
当金属颗粒接近J774A.1巨噬细胞时，细胞伸出伪足逐渐将较小的颗粒（2 μm左右）吞噬入细胞内（图12），此时细胞开始胀大，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，表示分泌活动活跃，颗粒进入细胞成为吞噬体。胞浆的密度变得不均匀，有空泡样变（图13）。
2.4 RT-PCR测定巨噬细胞的IL-6和TNF-α表达
结果显示：与空白对照组比较，J774A.1巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti-Nb-Zr合金颗粒共同培养后都有IL-6和TNF-αm RNA表达的增加，培养48 h比24 h组mRNA表达增加更为明显。TNF-α增加程度比IL-6更加明显。3种材料比较，24 h组差别不大；48 h，钴铬钼颗粒引起细胞表达TNF-α明显增加，形成明亮的条带，钛铝钒颗粒也引起类似变化，只是程度较轻。Ti-Nb-Zr颗粒引起上述变化更加轻微（图14）。
2.5 巨噬细胞培养上清的TNF-α测定（表3）
J774A.1巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti-Nb-Zr合金颗粒共同培养24 h后都未引起细胞TNF-α分泌增加，与空白对照组比较无显著性差异（P>0.05），３种材料之间也无显著性差异（P>0.05）。作用48 h后，空白对照组和Ti-Nb-Zr组TNF-α测定值明显下降，低于钛铝钒组和钴铬钼组（P<0.05），Ti-Nb-Zr组低于对照组，但差异不显著（P>0.05）。表3 J774A.1巨噬细胞培养上清的TNF-α测定值注：*Ti-Nb-Zr组与钛铝钒组和钴铬钼组比较，差异显著P<0.05。**对照组与钛铝钒组和钴铬钼组比较，差异显著P<0.05。
3 讨 论
3.1 钛与钛合金的生物相容性
纯钛和钛合金具有出色的生物相容性主要归功于表面氧化层。钛表面氧化层的特点包括：(1)氧化钛具有较低的固有毒性；(2)氧化钛在水中的溶解性能很低；(3)氧化钛与生物分子的反应活性很低，接近化学惰性；(4)过氧化物具有明显的抗炎作用。
正常人体液中含有水、葡萄糖、聚糖、蛋白质、类脂、大约0.9%的氯化钠，以及微量的Ca2+、Mg2+ 、Na+、K+、Cl-、OH-、PO3-４等离子，正常情况下pH值为7.4左右。由于它是一种含盐电解质溶液，促进了电化学机制的腐蚀和水解，组织中的有机分子和细胞有加快化学反应或迅速破坏外来成分的能力。大量的体内、体外实验证实几乎所有的金属在体内都会有物质释放到周围组织中。
生物环境的复杂性决定了材料-组织之间反应的复杂性。决定生物金属材料生物相容性的主要因素有剂量、元素的固有毒性及结合大分子的能力。金属离子与组织分子之间形成的络合物是引起组织反应的一个重要因素。因此，金属与生物材料之间反应活性是评价金属毒性的重要指标。金属与大分子结合能力与金属氢氧化物的水解程度有关。钛氢氧化物的溶解常数较低（Kd<105），另外，氧化钛在水溶液中呈弱酸性（pKa=18），因此钛生物分子络合物的反应也需要较高的pKa，反应在正常体液环境下很难进行。也就是说钛具有很大的生物惰性。这可能与钛的击穿电压高（2.4 V）有关。
钛具有较小的组织反应特性还与氧化钛的介电常数有关。氧化钛在室温下以板钛矿、锐钛矿和红金石的形式存在，三者的介电常数分别为78、48、110 kHz。其平均介电常数与水近似，表明钛在水溶液中因极化而产生的静电力较小。蛋白质分子就是在极化作用产生的静电引力下向生物材料的表面靠近。因此，在体内环境下，钛表面吸附蛋白质分子的可能性较小。
另外氧化钛的等电点对钛的生物学行为也有很大的影响。报告氧化钛的等电点为6.2，稍低于体液的pH值，这表明氧化钛在生理环境下会带有微弱的负电荷。大量的体内体外实验表明这种负电荷的表面对于生物材料和周围的活体骨之间的骨性结合密切相关。体液中的Ca2+在库仑力的作用下与氧化钛表面的负电荷结合，而表面的OH-将通过氢键吸引PO3-４向表面聚集，当过饱和度大于非均质磷灰石成核所需的临界值时，磷灰石晶核就会形成并自发长大［6］。
图1 Ti-Nb-Zr变形合金 图2 作为空白对照组的J774A.1巨噬细胞培养24 h后的形态（100×） 图3 作为空白对照组的J774A.1巨噬细胞培养24 h后的形态（200×）细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无吞噬小体 图4 钛铝钒颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（100×） 图5 钛铝钒颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（200×）细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，胞浆内有被吞噬的颗粒影像↑ 图6 钴铬钼颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（100×） 图7 钛铝钒颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（200×）与钴铬钼颗粒共同培养的细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂。仍可见胞浆内被吞噬的颗粒影像↑ 图8 Ti-Nb-Zr颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（100×） 图9 Ti-Nb-Zr颗粒与J774A.1巨噬细胞共同培养24 h后的形态（200×）
另外在炎症阶段，由激活白细胞所释放的出来的H2O2会与钛的氧化层发生反应，增加氧化钛溶解速度的同时使氧化层的厚度增加。Sundgren将钛从体内取出时发现氧化层保存完好且随时间延长厚度增加。体外实验表明，钛表面经H2O2处理后O/Ti比例增大，与水的接触角度<8°，这种亲水表面将会吸附水和氧，从而将钛的氧化表面与周围的空气隔绝。另外氧化钛表面还原反应将形成一种或多种氢氧化物、过氧化物、超氧化物，这些物质在氧化物表面的化学结合降低了表面自由能，是其具有低的碳反应活性的一个原因。而低的碳反应活性意味着低的炎性作用。
3.2 β钛合金的生物相容性研究
Roger在金属磨损颗粒与巨噬细胞共同培养的实验中发现钛合金中的钒能刺激巨噬细胞产生更多的骨吸收因子，这些细胞因子在人工关节松动中起重要作用，所以β钛合金的趋势是选用生物相容性更好的元素。这是β钛合金生物相容性优良的物质基础。
早期的β钛合金用钼取代了有细胞毒性的钒和铝。Khan证实Ti-15Mo(TM)在模拟体液环境下有良好的耐腐蚀性能。在705例病人中作的金属敏感性实验说明含钼的β钛合金不会引发变态反应。的β钛合金则倾向于选取生物相容性更好的铌、锆、铊、钸等元素，如Long［7］证实了Ti-13Nb-13Zr的生物相容性优良。Ti-50Zr合金在Ringer's和PBS液体中容易形成表面氧化膜，因而生物不敏感性［8］。日本学者研制的Ti-29Nb-13Ta-4.6Zr在体外实验中表现出良好的生物相容性［9、10］。有研究表明，通过生物相容性元素Nb 、Ta、 Zr的严格组合可使潜在的组织反应达到最小。
图10 正常J774A.1巨噬细胞（3000×） 图11 正常J774A.1巨噬细胞（6000×）正常的J774A.1巨噬细胞透射电镜下为圆形或椭圆形，细胞体积较大直径约10 μm，细胞周边有绒毛样突起↑。胞浆丰富，一般没有大量的吞噬体，核染色质分布均匀。图12 正在吞噬金属颗粒的J774A.1巨噬细胞（12000×） 图13 吞噬了金属颗粒的J774A.1巨噬细胞（12000×），可见细胞伸出伪足逐渐将较小的颗粒（2 μm左右）吞噬入细胞内，此时细胞开始胀大，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，表示分泌活动活跃，颗粒↑进入细胞成为吞噬体。胞浆的密度变得不均匀，有空泡样变。 图14 不同材料作用于J774A. 1细胞后细胞因子mRNA的表达（Expression of cytokines mRNA in J774.A1 cell line after stimulation by different materials）1.空白对照 2、5.钛铝钒颗粒分别刺激24、48 h 3、6.Ti-Nb-Zr分别刺激24、48 h 4、7.钴铬钼分别刺激24、48 h
生物相容性是每一种新型生物材料进入临床应用以前必需认真考虑的问题。生物相容性评价是一个非常广义的概念，包括体外动态凝血实验、细胞毒性实验等体外评价方法和皮肤过敏实验、皮内刺激实验、黏膜刺激实验、急性全身毒性实验、溶血实验、热源实验、体内植入实验等体内实验。在长期的研究中形成了特定材料生物相容性评价的所谓“国家标准”。本实验借鉴了“中华人民共和国国家标准”GB/T16175—1996中的“医用有机硅材料生物学评价实验方法”对Ti-Nb-Zr合金进行细胞毒性实验，为体内实验和动物实验提供依据。实验证实Ti-Nb-Zr的细胞毒性为0级，生物相容性优良。
作者研制的Ti-Nb-Zr合金是一种骨科内固定材料或人工关节假体材料，而假体材料磨损颗粒引发的巨噬细胞介导的破骨细胞性骨吸收是晚期松动的主要原因［1、2］，因此在评价一种人工关节材料的生物反应性时，观察巨噬细胞吞噬磨损颗粒后，分泌骨吸收因子（IL-1、IL-6、TNF等）的量非常重要，后者可增量破骨细胞及其功能，导致骨溶解和假体松动。因此作者采用体外检测磨损颗粒对巨噬细胞功能及其产生骨吸收因子的影响，以反映材料的生物相容性和引起假体松动可能性的大小。结果表明吞噬了Ti-Nb-Zr颗粒的J774A.1巨噬细胞形态改变明显轻于钴铬钼颗粒组和钛铝钒颗粒组。巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti-Nb-Zr颗粒共同培养48小时后都有IL-6和TNF-α mRNA表达的增加，钴铬钼颗粒和钛铝钒颗粒引起增加更加明显。ELISA方法测定显示：巨噬细胞吞噬Ti-Nb-Zr颗粒48小时后分泌TNF-α的量明显低于钛铝钒和钴铬钼（P<0.05）。上述结果表明：如果作为人工关节材料，Ti-Nb-Zr具有减轻假体松动的可能。
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