罗格列酮对糖尿病大鼠肾组织nephrin表达的影响
【摘要】 目的： 探讨糖尿病大鼠肾组织nephrin的表达以及罗格列酮干预后对其表达的影响。方法： 链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型，将糖尿病大鼠随机分为糖尿病非干预组（DM组）和罗格列酮干预组（DR组），并以正常组（NC组）作对照。干预8周后，观察各组大鼠尿蛋白、血糖、血脂、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）变化；用免疫组化及实时荧光定量PCR检测肾组织nephrin蛋白及mRNA的表达。结果： ①DM组大鼠尿蛋白、血BUN,Cr较NC组明显升高，肾组织nephrin蛋白及mRNA表达降低；与DM组相比，DR组大鼠尿蛋白、血BUN,Cr降低，nephrin蛋白及mRNA表达上调。②DM组血糖、血脂与NC组相比，差异有统计学意义，与DR组比较差异无统计学意义。结论： 罗格列酮可能通过上调糖尿病大鼠肾组织nephrin表达，发挥不依赖糖脂代谢的直接肾保护作用。
【关键词】 糖尿病肾病； 罗格列酮; nephrin
［Abstract］ Objective: To investigate the effect of rosiglitazone on the expression of nephrin in the kidney of diabetic rats.Methods： Diabetic model was established by a single injection of streptozotocin(STZ), and diabetic rats were randomly divided in to 2 groups: untreated diabetes mellitus group(DM group) and rosiglitazone-treated diabetes mellitus group(DR group). In addition, the normal rats served as a normal control group(NC group). Eight weeks later, the excretion of urine protein, blood glucose, serum lipid profile, serum urea nitrogen and serum creatinine were detected. The expression of nephrin was detected by immunohistochemistry and real-time Q-PCR. Results： Compared with NC group, the excretion of urine protein, serum urea nitrogen and serum creatinine in DM group were significantly increased, and the expression of nephrin was significantly down-regulated. Compared with DM group, the excretion of urine protein, serum urea nitrogen and serum creatinine in DR group were significantly decreased, and the expression of nephrin was significantly up-regulated. Blood glucose and serum lipid profile were significantly changed in DM group compared with NC group, while they had no significant difference between DM group and DR group. Conclusion： Rosiglitazone may up-regulate the expression of nephrin in the kidney of diabetic rats to produce direct nephroprotective effects independent of glucose and lipid metabolism.
［Key words］ diabetic nephropathy; rosiglitazone; nephrin
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)时肾小球滤过屏障功能障碍与蛋白尿的发生密切相关。裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)是限制蛋白滤过的主要屏障，近年来已认识到足细胞SD上的蛋白分子nephrin是肾小球滤过屏障选择性功能的关键。在未出现明显肾脏组织学损害和显著蛋白尿前，nephrin的表达已经明显下降［1］。罗格列酮属于过氧化物酶增殖体激活受体γ(peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPARγ)激动剂，是用于2型糖尿病的胰岛素增敏剂。近来的研究发现，罗格列酮除胰岛素增敏作用外能有效地减少糖尿病微量白蛋白排出率，具有潜在的肾保护作用［2］，但有关罗格列酮对DN的确切肾保护机制尚不甚清楚。本研究旨在观察罗格列酮对DN大鼠肾组织nephrin表达的影响，进一步探讨其直接肾保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立与分组
雄性SD大鼠20只，体质量200～250 g，购于江苏大学医学院动物实验中心。适应性喂养1周后，用枸橼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH4.4）新鲜配置的1%链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma)给14只大鼠腹腔注射，剂量为55 mg/kg。正常对照组（NC组，n=6），仅注射同等剂量的枸橼酸缓冲液。注射72 h及7 d后，尾静脉采血，用血糖仪测定血糖，血糖均大于16.7 mmol/L且尿糖强阳性并出现多饮、多尿、多食、体质量减轻入选糖尿病模型。将糖尿病大鼠随机分为两组，糖尿病非干预组（DM组，n=6）和罗格列酮干预组（DR组，罗格列酮原粉7 mg·kg-1·d-1灌胃，太极集团，n=8）。正常对照组与糖尿病非干预组以等剂量蒸馏水灌胃。
1.2 标本收集
干预8周后处死大鼠。处死前代谢笼收集24 h尿，待测尿蛋白、尿肌酐。处死当天尾静脉采血测血糖，以盐酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏取血待测血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）、血脂。肾脏经生理盐水灌洗后测肾重，肾脏肥大指数以：肾重/体质量×1 000 表示。右侧肾脏-70℃冻存以备荧光定量PCR检测。左侧肾脏4%低聚甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm切片，以备病理组织学、免疫组织化学检查。
1.3 血、尿标本检测
用日本爱科来血糖仪尾静脉采血测定血糖；日本奥林巴斯全自动生化分析仪测定血脂、血Cr、血BUN、尿Cr，并内生肌酐清除率（Ccr），Ccr=尿Cr/血Cr×24 h尿量；用双缩脲法测定尿蛋白定量。
1.4 肾脏病理检查及免疫组织化学
所做标本切片，行HE染色。采用EnVision法检测nephrin。石蜡切片脱蜡至水后加抗原修复液，高温热修复；滴加一抗为兔抗nephrin多克隆抗体（1∶200，Santa Cruz），4℃孵育过夜；滴加二抗为抗兔EnVision多聚物(DAKO公司)，室温下孵育；最后加入DAB显色液（福州迈新公司），显微镜下控制显色，脱水，透明，封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。显色结果在高倍镜 （400×）下随机选取10个连续不重复的视野，以胞质出现金黄色或棕黄色颗粒为阳性信号，免疫组化阳性指数用阳性面积×阳性强度表示，计算方法如下，阳性面积：阴性无着色0分，＜25%着色1分，25%～49%着色2分， 50%～75%着色3分，＞75%着色4分；阳性强度：阴性无着色0分，弱阳性1分，中等阳性 2分，强阳性3分。取平均值作半定量分析，为该阳性物质的相对含量。
1.5 实时荧光定量PCR测定nephrin mRNA
每份标本取肾皮质100 mg，加入Trizol（ABI基因公司）1 ml提取总RNA，以总RNA为模板，反转录合成cDNA。nephrin引物序列上游：5′-CGAGGCACTCCGTGAAAC-3′，下游：5′-GCCTCGGAAGGTCCAGTT-3′，175 bp；GAPDH引物序列上游：5′-GGCATCCTGACCCTGAAGTA-3′，下游：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′，121 bp，由广州达晖生物公司合成。采用ABI Prism 7300 SDS PCR仪进行实时定量PCR反应（SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，广州达晖生物公司）。PCR反应参数： 预变性95 ℃ 15 min，然后95 ℃变性20 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个循环后采集荧光生成扩增曲线，并在反应后生成熔点曲线。计算方法：待测样品mRNA相对表达量=2-ΔCT×100%; ΔCT=目标基因CT值-内参（GAPDH）CT值，采用仪器自带软件（ABI Prism 7300 SDS Software）分析各组nephrin mRNA的相对表达量。
1.6 统计分析
应用SPSS11.5软件，计量资料用(x±s)表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。指标之间的关系采用Pearson′s直线相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般指标的变化
DM组大鼠肾重、肾脏肥大指数、血糖、尿量增加，体质量下降，与NC组相比，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；DR组大鼠与DM组比较，其尿量降低（P<0.05），但体质量、肾重、肾脏肥大指数、血糖差异无统计学意义。见表1。
表1 各组大鼠一般指标的变化（略）
Tab 1 Change of common index in different groups
与NC组相比，a：P<0.05，b：P<0.01；与DM组相比，c ：P<0.05
DM组大鼠血BUN、血Cr、尿蛋白较NC组增高，Ccr降低，差异有统计学意义（P均<0.01）；DR组大鼠比DM组尿蛋白、血BUN、血Cr减少，Ccr增高（P<0.05或P<0.01），见表2。DM组较NC组大鼠三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）增高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）下降（P<0.05或P<0.01）；DR组大鼠与DM组相比，TG,TC,HDL-C,LDL-C差异均无统计学意义，见表3。
表2 各组大鼠血BUN、血Cr、尿蛋白、Ccr的变化（略）
Tab 2 Change of serum BUN, Cr, urine protein and Ccr in different groups
与NC相比，b：P<0.01；与DM相比，c：P<0.05，d： P<0.01
表3 各组大鼠血脂的变化（略）
Tab 3 Change of serum lipid profile in different groups
与NC组相比，a： P<0.05，b： P<0.01
2.3 肾组织病理形态学变化
光镜HE染色显示，与 NC组相比，DM组表现出明显的肾小球体积增大，系膜细胞显著增多，基质增生，肾小球毛细血管壁狭窄，并可见部分肾小管上皮细胞空泡变性，肾小管周围炎症细胞浸润；而DR组与DM组比较肾小球基质及系膜细胞数减少，毛细血管袢开放良好，系膜基质轻微增生，炎症细胞浸润不明显，部分小管上皮开始出现修复。见图1。
2.4 肾脏免疫组化结果
NC组大鼠肾脏nephrin仅在肾小球表达，沿肾小球毛细血管袢呈线状分布，肾小管和肾小囊无表达。DM组大鼠肾小球nephrin表达(1.52±0.41)显著低于NC组（7.07±0.63），P<0.01。在部分肾小球中，nephrin呈颗粒状分布；DR组肾小球内nephrin的量（4.08±0.33）比DM组（ 1.52±0.41）升高，P<0.01。见图2,图3。
图3 各组大鼠nephrin 免疫组化结果（略）
Fig 3 Immunohistochemical result of nephrin
2.5 荧光定量PCR结果
DM组大鼠肾组织nephrin mRNA表达（0.0415±0.0183）比NC组（0.3186±0.0683）减少，P<0.01；DR组nephrin mRNA表达（0.1349±0.0654）高于DM组（0.0415±0.0183），P<0.05。见图4。
2.6 直线相关分析
24 h尿蛋白定量分别与 nephrin mRNA,nephrin免疫组化表达呈显著负相关（r=-0.824, P<0.01；r=-0.878, P<0.01）。
图4 各组大鼠nephrin mRNA的相对表达量（略）
Fig 4 Relative mRNA expression of nephrin
3 讨论
糖尿病肾病时，nephrin等表面功能蛋白表达的下调以及足突融合脱落等病理改变，导致了蛋白尿的发生［3］。Toyoda等［4］研究证实人类 DN 时nephrin mRNA表达下降, 进而引起足细胞及裂孔隔膜结构和功能损伤，并随肾脏病变的恶化而进一步加剧。在本研究中，我们也发现糖尿病大鼠肾小球nephrin基因和蛋白表达均显著降低，部分肾小球中 nephrin蛋白的分布发生改变，由沿肾小球毛细血管袢的线状分布转为更多地呈颗粒状分布；同时，糖尿病组大鼠尿蛋白、血Cr，BUN亦显著增高，nephrin的表达与尿蛋白呈显著负相关。这表明糖尿病大鼠肾小球裂孔膜关键蛋白nephrin基因和蛋白表达及分布存在明显异常，裂孔膜结构和功能的完整性受损, 肾小球滤过屏障通透性发生改变，从而促进糖尿病肾脏损害和蛋白尿的发生。
罗格列酮可以有效地减少早期糖尿病微量白蛋白排出率，可能与激活组织的PPARγ有关［2］。PPARγ是一类配体激活的核转录因子超家族成员，一旦与配体结合活化后，PPARγ与维A酸类X受体(RXR)结合形成一个异二聚体，然后招募一系列协同因子，后者则在含PPAR反应元件(PPRE)特定基因的启动子区域与异二聚体结合，起到调节基因转录的作用。免疫组织化学证明PPARγ蛋白在肾小球系膜细胞和上皮细胞核中、近端和远端小管、髓襻、髓质集合管、肾脉管系统的血管内膜、血管中层中均有广泛表达［5］。因此罗格列酮可能通过激活肾组织的PPARγ，调节其下游基因的转录。实验中我们发现罗格列酮干预后糖尿病大鼠肾脏nephrin表达上调且尿蛋白减小，血BUN，Cr降低，Ccr增加，提示罗格列酮可能通过上调nephrin的表达，降低蛋白尿，保护肾功能。Benigni 等［6］认为在被动型Heymann肾炎（Passive Heymann Nephritis，PHN）大鼠模型中，吡格列酮通过启动子上特定的PPRE途径使nephrin基因的转录增强，发挥了其肾保护作用。因此，我们推测在糖尿病大鼠模型中，罗格列酮可能通过激活肾组织PPARγ，使其与nephrin启动子上特定的PPRE序列结合，调节nephrin的转录来发挥肾保护作用。本实验采用STZ一次性较大剂量腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型，使其胰岛功能可能在一开始就遭到破坏，所以罗格列酮的胰岛增敏作用不能充分发挥。在实验中我们也发现用罗格列酮干预后，糖尿病大鼠的血糖、血脂未发生明显改变，这就提示罗格列酮减少蛋白尿可能与它的降血糖、降血脂作用无关，即提示罗格列酮可能通过上调nephrin的表达而发挥直接肾保护作用。
综上，罗格列酮可能通过激活肾组织PPARγ，上调肾组织nephrin表达，发挥不依赖降糖、降脂的直接肾保护作用。这为罗格列酮防治糖尿病肾病提供了新的机制。
（本文图1～图2见彩图插图）（略）
【】
［1］ Doublier S, Salvidio G， Lupia E， et al. Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin Ⅱ［J］. Diabetes, 2003, 52(4):1023-1030.
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