慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

【摘要】  目的： 分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法： 采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果： 分离培养出人骨髓来源的MSCs，并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论： 获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰，为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。

【关键词】  间质干细胞; 慢病毒; 转染

　　［Abstract］  Objective: To isolate and culture mesenchymal stem cells（MSCs） derived from human bone marrow and transfect the cells by lentiviral vectors.Methods： The tissue adherent culture method was used to isolate MSCs from human bone marrow. The MSCs were transfected by lentiviral vectors using lipofectamine 2000. Results： Human bone marrow MSCs were successfully isolated and efficiently transfected by EGFP-expressing lentiviral vectors. Conclusion： Human bone marrow MSCs have been  transfected by lentivirus, which will play a role in researching on the function of MSCs in gene and tissue engineering.

　　［Key words］  mesenchymal stem cells； lentiviral vector;  transfection

　　间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源。MSCs增殖能力强，体内外均具有多向分化潜能，基因修饰后保持原有多潜能性的同时可持续稳定表达外源基因；体外转染和培养一段时间移植至体内仍可存活，并能够迁移至病变部位,因而其成为基因研究领域令人关注的靶细胞［1］。因此，本研究从人骨髓组织中分离培养出MSCs并体外扩增用于慢病毒转染，为进一步利用MSCs进行基因治疗奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本和主要试剂
 
　　成人骨髓（江苏大学附属），慢病毒三质粒系统FUGW，pCMVR-delta8.9和VSVG（上海医学遗传所惠赠），人胚肾293 T（本实验室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Toyobo公司），PCR试剂（Takara公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB公司）。引物设计采用primer premier 5.0软件，由上海生物工程有限公司合成。

　　1.2  主要仪器
 
　　二氧化碳培养箱（Forma公司），Beckman SW28 Rotor超速离心机（Beckman公司），PCR仪（Thermo Hybaid公司），流式细胞仪(FACS Calibur, BD公司)，倒置式生物显微镜(TE300, Nikon公司)，细胞培养瓶和培养皿（Corning公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  人骨髓MSCs的分离扩增  根据本室建立的方法分离培养人骨髓MSCs［2］。主要操作如下：新鲜分离的骨髓液5 ml加入含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，用吸管吹打混匀后，800 r/min离心10 min去除含脂滴上清。细胞沉淀种在含10%胎牛血清的L-DMEM营养液中，37℃、 5%CO2饱和湿度培养。5 d后半量换液, 第7～10天后见有较多贴壁细胞后全量换液，此后每3天换液1次。细胞80%左右融合时, 用含0.1 mmol EDTA-Na2的0.25% 胰酶室温消化, 细胞沉淀按1∶3比例传代。待其生长接近融合层时，即得到人骨髓来源的MSCs。

　　1.3.2  人骨髓MSCs表面标志检测  取1×105第3代人骨髓MSCs与FITC或PE标记的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30 min后，经流式细胞仪检测。阴性对照为FITC结合的鼠IgG1和PE结合的鼠IgG1。

　　1.3.3  慢病毒包装  在包装前1天种植293 T细胞，10 cm盘中细胞密度为6×105个细胞/盘，含10% FBS的L-DMEM 10 ml/盘培养过夜。第2天转染前换成无血清培养液，然后将15 μg FUGW与12 μg辅助质粒pCMVR-delta8.9，9 μg包膜质粒VSVG用无血清培养液稀释至1.5 ml，同时将30 μl 的lipofectamine 2000脂质体复合物稀释至1.5 ml，室温静置5 min后将脂质体复合物加至质粒复合物中，混匀后室温静置15 min。将上述混合体系加入293 T细胞中，8～16 h后换成含10% FBS的L-DMEM，每盘10 ml，37℃、5％CO2培养。48～72 h后收集病毒上清，1 000 r/min离心15 min去除细胞碎片后，15 000 r/min，4℃超速离心2 h浓缩病毒，用无血清培养液溶解病毒沉淀后分装保存于-70℃低温冰箱。

　　1.3.4  慢病毒滴度测定  滴度测定前1天种293 T细胞，6孔板中细胞密度为5×104个细胞/孔，含10% FBS的L-DMEM为2 ml/孔，第2天取1 μl浓缩病毒液加入事先种好的细胞中，加入终浓度为8 μg/ml的Polybrene置培养体系中以提高感染效率。37℃、5%CO2培养箱培养，1周后用流式细胞仪检测阳性率。滴度公式：滴度（TU/μl)=阳性率(％)×细胞总数×病毒液稀释倍数/病毒液体积（μl）。

　　1.3.5  慢病毒感染人骨髓MSCs  取第3代生长旺盛的人骨髓MSCs消化并计数，将5×104个细胞与病毒液在8 μg/ml的Polybrene存在下，30℃，2 500 r/min离心作用2～4 h后，种回至12孔板中，每孔加含10%FBS的L-DMEM 1 ml继续培养过夜。12 h后换液，此后每2～3 d换液1次并观察荧光表达情况，培养1～2周后流式分析转染效率。

　　1.3.6  PCR分析  酚氯仿异戊醇法抽提转染前和转染后人骨髓MSCs的DNA，Trizol法提取转染前和转染后人骨髓MSCs的RNA。分别以DNA和逆转录得到的cDNA为模板，检测病毒载体FUGW的基因片段。反应体系为: 10×PCR缓冲液 2.5 μl、模板 0.5 μl，dNTPs 0.5 μl（10 mmol）、MgCl2 1.5 μl（25 mmol）、上下游引物各0.5 μl（10 μmol），40 U Taq聚合酶0.2 μl、用ddH2O补足至25 μl 。PCR循环参数为：94℃预变性，5 min，94℃ 30 s，59℃/56℃（内参β-actin） 30 s，72℃ 30 s，35个循环扩增，最后72℃ 10 min结束反应。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段大小。同时将10 μl慢病毒浓缩液100℃煮沸10 min后置冰上15 min，取2 μl作模板，PCR检测载体基因片段，反应同上。引物序列和PCR扩增产物长度见表1。

　　表1  PCR引物序列（略）

　　Tab 1  Primer sequences for PCR

　　1.3.7  细胞动力学检测  取生长状态良好的未转染人骨髓MSCs(对照组)和转染后人骨髓MSCs(实验组)，消化成单细胞悬液，种植于24 孔板，细胞数量为3×103/孔，在相同条件下培养，每24 h取出2孔计数取均值，以培养时间为横坐标，细胞数量为纵坐标绘制转染前后人骨髓MSCs的1～12 d胞生长曲线。

　　1.3.8  诱导分化实验  取转染后人骨髓MSCs于35 mm培养盘中进行诱导。细胞数量为3×104/盘, 在1.5 ml的含10% FBS的L-DMEM中进行培养。成骨分化诱导体系为: 1 μmol地塞米松、50 mg/L 维生素C，100 mmol β-磷酸甘油、4 mg/L bFGF；成脂诱导体系为：1 μmol地塞米松、0.5 μmol 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 μmol胰岛素、200 μmol吲哚美辛。对照组不加入任何诱导剂。培养14 d后取出进行碱性磷酸酶和油红O染色。

　　2  结果

　　2.1  人骨髓MSCs分离培养和表面标志
 
　　全骨髓组织原代贴壁培养5 d后，倒置显微镜下观察见单个或少量集落生长的贴壁细胞，呈短梭形或针尖状。随细胞培养时间延长，细胞集落不断地扩大并形成融合单层，细胞形态大多呈长梭形或多角形(图1)。流式分析显示CD13，CD29， CD44，CD105，HLA-Ⅰ表达阳性，CD31，CD34，HLA-DR阴性表达(图2)，表明获得人骨髓来源的MSCs。

　　(a) 骨髓组织原代培养第7天(×100)  

　　(b) 骨髓组织原代培养第7天(×200)

　　图1  人骨髓MSCs的形态学特征（略）

　　Fig 1  Morphological characteristic of human　bone marrow MSCs

　　依次为CD13，CD29，CD44，CD105，HLA-1阳性表达；CD31，CD34，HLA-DR阴性表达

　　图2  流式检测人骨髓MSCs表面标志（略）

　　Fig 2  Immunophenotypes of human bone marrow MSCs

　

　2.2  慢病毒包装
 
　　脂质体法介导慢病毒三质粒系统包装人胚肾293 T细胞后48 h达到最强，效率达80％以上（图3a,3b）。以1 μl浓缩后病毒液感染人胚肾293 T细胞测定病毒滴度，48 h后荧光显微镜观察可见明显荧光（图3c），流式分析显示约70％的293 T细胞表达EGFP(图3d)，表明成功包装出有活性的慢病毒。根据滴度公式出浓缩后的病毒液滴度为3.5×107 TU/ml，适用于感染人骨髓MSCs。
 
　　2.3  慢病毒感染人骨髓MSCs
 
　　以不同病毒感染复数(MOI）进行慢病毒感染人骨髓MSCs，可见转染效率随MOI增加而增加，但超过一定MOI值时转染阳性率反而出现下降（图4a）。在MOI=5时，离心力作用下的转染效率是静态转染的2倍左右（图4b）。慢病毒转染人骨髓MSCs后传代培养可见EGFP高效稳定表达（图5）。
 
　　a：不同病毒感染复数，1～5依次为0.25,2.5,5,12.5,25； b：不同转染方式，1～2依次为静态感染和离心力作用感染

　　图4  不同MOI或转染方式下慢病转染人骨髓MSCs（略）

　　Fig 4  Lentiviral transfection of human bone marrow　MSCs in different MOI and ways

　　2.4  PCR分析
 
　　以慢病毒浓缩液以及慢病毒感染人骨髓MSCs的DNA和cDNA为模板进行PCR检测慢病毒载体基因，均可见目的条带，条带大小为412 bp（图6）。
 
　　1:空白; 2:阳性对照; 3:慢病毒感染hBMMSCs的DNA; 4:慢病毒感染hBMMSCs的cDNA; 5:慢病毒浓缩液;M:标准参照物

　　图6   PCR检测病毒载体质粒基因（略）

　　Fig 6  PCR analysis for gene sequence of lentiviral　vector FUGW

　　2.5  细胞生长曲线
 
　　慢病毒转染后的人骨髓MSCs生长曲线呈典型“S”型，倍增时间约45 h，与未转染组基本一致（图7）。
 
　　图7  慢病毒感染人骨髓MSCs生长曲线图（略）

　　Fig 7  Growth curve of lentiviral-transfected human　bone marrow MSCs

　　2.6  诱导分化
 
　　慢病毒感染后的人骨髓MSCs在成骨和成脂诱导条件培养液中诱导14 d后进行碱性磷酸酶和油红O染色分析。成骨诱导盘中可见大多数细胞碱性磷酸酶染色呈阳性（图8a）。成脂诱导后的细胞中有大量的油红O阳性的脂肪滴(图8b)。而对照组在14 d培养后没有成骨细胞及脂肪细胞的形成(图8c，图8d)。

　　3  讨论
 
　　间质干细胞最早发现是存在于骨髓的一类非造血干细胞，是骨髓的造血微环境。后来研究发现还分布于体内多种组织器官如肝脏、脂肪、骨骼肌等。MSCs具有多向分化潜能，体内外可向骨、软骨、肌腱、韧带、脂肪细胞、心肌细胞及神经细胞等分化。此前，本实验室已经分离培养了大鼠、胚胎和成人骨髓的MSCs，并且成功地在体外将人骨髓MSCs诱导为心肌细胞、神经细胞、成骨细胞［3-6］。最近我们又成功从人脐带组织分离培养出MSCs［7］，随后的鉴定也证实其具有与人骨髓MSCs相似的形态学、生物学和遗传学特征。但骨髓组织仍然是目前MSCs的主要获取来源，由于MSCs来源简便、易于分离和扩增稳定，所以是很好的基因工程靶细胞。
 
　　与其他病毒载体系统相比，慢病毒具有能够转染分裂和非分裂的细胞并稳定表达基因,无明显免疫反应等特性，同时能够转染广泛的组织、能够被浓缩成高滴度等优点。EGFP作为报告基因具有观察简单方便和直观的优点，EGFP在470 nm波长处可吸收激发光,在510 nm发射绿色荧光,只要有足够的表达,可以直接进行活体状态下的活性观察，克服了其他报告基因如LacZ，β半乳糖苷酶和荧光素酶等需要底物及维持时间短的缺点。
 
　　本研究用携带EGFP报告基因的慢病毒载体转染人骨髓来源MSCs，转染后的人骨髓MSCs的生长状态、增殖与转染前相一致,说明慢病毒载体携带EGFP转染在一定范围内不影响人骨髓MSCs的生长特性。研究发现慢病毒转染效果与转染MOI值和转染方式有密切关系，转染效率在所用的MOI值范围内随其增加而升高，但超过一定MOI值时转染阳性率反而出现下降。原因可能是在过高的MOI值下，病毒的细胞毒性致使细胞死亡，引起转染效率的降低。此外，发现离心力作用下的转染效率相对静态转染效率要高，可能是离心力作用增加了病毒与细胞接触机会从而增强感染效率。体外传代培养发现慢病毒转染后人骨髓MSCs可稳定表达EGFP。本研究分析了慢病毒载体基因在人骨髓MSCs的表达情况，PCR结果表明可从人骨髓MSCs的DNA和cDNA中扩增出病毒载体基因，说明慢病毒将其自身基因稳定整合于人骨髓MSCs基因组中。本研究证明了转染后的人骨髓MSCs体外具有成骨和成脂分化特性，这说明慢病毒转染人骨髓MSCs没有改变其多向分化的潜能。
 
　　综上所述，本研究建立了一种有效、稳定、持久的人骨髓MSCs荧光基因标记技术，研究表明慢病毒转染的人骨髓MSCs保持了其基本生物学特性和多潜能分化能力，为研究MSCs的转归、可塑性及基因治疗奠定了基础。
 
　　（本文图3，图5，图8见彩色插图）（略）

【】
  　　［1］ Van Damme A,Vanden Driessche T,Collen D,et al. Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy［J］. Curr Gene Ther,2002,2(2):195-209.

　　［2］ 孙晓春,许文荣,许化溪,等.不同来源的人间质干细胞分离与基本生物学特性研究［J］.江苏大学学报：医学版,2005,15(5):369-372.

　　［3］ Xu W,Zhang X,Qian H,et al.Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro［J］.Exp Biol Med,2004,229(7):623-631.

　　［4］ 孙晓春,许文荣,姚 堃,等.胎儿骨髓间质干细胞体外诱导为神经细胞的初步实验研究［J］.生物医学工程学报,2003,23(1):40-43.

　　［5］ 朱 伟,许文荣,孙晓春,等.骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究［J］. 生物医学工程研究,2003,22(3):41-43.

　　［6］ 孙晓春,许文荣,朱 伟,等.大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究［J］.江苏大学学报：医学版,2004,14(5):369-374.

　　［7］ Qiao C，Xu W，Zhu W, et al. Human mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord［J］. Cell Biol Int,2008,32(1):8-15.