白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CCR5表达的影响
【摘要】 目的： 观察白藜芦醇对人外周血单核/巨噬细胞CC型趋化因子受体5(CCR5) 表达的调节作用。方法： 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞。采用IFN-γ（1×105U/L)诱导单核/巨噬细胞表达CCR5，再分别加入不同浓度的白藜芦醇(0.5，5，25，50和100 μmol/L)进行干预。培养24 h后收集细胞，RT-PCR法检测外周血单核/巨噬细胞CCR5 mRNA表达水平；流式检测单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率。同时将CCR5荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5）转染各组细胞，检测各转染组的荧光素酶相对活性。结果： 中、高浓度白藜芦醇处理组（25,50和100 μmol/L）的CCR5 mRNA表达水平、CCR5阳性细胞率和CCR5-luc报告基因的荧光素酶相对活性比对照组均有所降低，低浓度白藜芦醇处理（0.5和5 μmol/L）对单核/巨噬细胞CCR5的表达无明显影响。结论： 中、高浓度白藜芦醇可抑制外周血单核/巨噬细胞CCR5的表达。
【关键词】 白藜芦醇； 单核/巨噬细胞； 巨噬细胞移动抑制因子； 报告基因； 趋化因子受体
［Abstract］ Objective: To study regulating efforts of resveratrol on the expression of CC-chemokine receptor-5(CCR5) in human peripheral monocyte/macrophage.Methods： Mononuclear cells were obtained from human peripheral blood by the method of Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. Macrophages were enriched by adherence. IFN-γ(1×105 U/L) were added into the medium to induce the cells expressing CCR5. Different concentration of RES(0.5， 5, 25, 50 and 100 μmol/L) were applied to the cells at the same time. Monocyte/macrophage were collected after cultured for 24 h, the expression level of CCR5 mRNA was detcted by RT-PCR and CCR5 positive cell rate was assayed by flow cytometry. CCR5 report gene were transfected into each group that mentioned above, the relative luciferase activity of CR5 report gene was tested by kit. Results： The expression of CCR5, rates of CCR5 positive cells and relative activity of CCR5 report gene was significantly decreased in RES（25,50 and 100 μmol/L）treated group compared with control group, while there were no significant difference between control group and RES 0.5 and 5 μmol/L treated group. Conclusion： Midst and high concentration of resveratrol have the efforts to inhibit the expression of CCR5 in human peripheral monocyte/macrophage.
［Key words］ resveratrol； monocyte； macrophage； CCR5； report gene; chemokine receptor
白藜芦醇(Resveratrol, RES, 3,5,4′-三羟基-均二苯代乙烯)是一种主要由葡萄属植物产生的成分，具有广泛的药理功能，如抗菌消炎、诱导肿瘤细胞凋亡、清除自由基、抗氧化、抗衰老、保肝、保护心血管、内分泌调节和免疫调节等［1］。2004年Krishnan等［2］首先报道了白藜芦醇的抗HIV-1作用，发现白藜芦醇可诱导处于感染潜伏期的HIV-1基因表达病毒抗原，从而刺激机体免疫系统的抗病毒作用［2］。2006年杨子峰等［3］利用感染HIV的小鼠模型证实了白藜芦醇的抗HIV作用。目前白藜芦醇的抗HIV作用越来越引起了人们的重视，但是对于白藜芦醇的抗HIV机制尚不清楚。众所周知CC型趋化因子受体5（CC-chemokine receptor-5, CCR5）在HIV-1病毒感染单核/巨噬细胞的过程中起到了非常重要的作用，CCR5与HIV-1的gp120结合后可以促进HIV-1病毒进入细胞，有很多抗HIV-1药物的靶位点正是CCR5［4］，我们推测白藜芦醇可能是通过下调单核/巨噬细胞CCR5的表达，从而起到抗HIV-1病毒作用。若果真如此,这将对揭示白藜芦醇的抗病毒机制起到非常重要的作用，也将为白藜芦醇抗HIV-1的药用价值提供重要的基础理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
健康人外周血（新乡医学院第一附属）；白藜芦醇(Sigma)；DMSO(Sigma)；IFN-γ（Sigma）；淋巴细胞分离液（上海生工）； lipofectamine 2000 Reagent(Promega) ；RES-荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5，含有CCR5启动子-416 bp～+61 bp)由日本Nagasaki大学Moriuchi博士惠赠； pGL3-Basic(Promega）；pGL3-Control(Promega)；荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa）；FITC-鼠抗人CD14单抗(PharMingen)；FITC-羊抗鼠IgG(PharMingen)；鼠抗人CCR5抗体(PharMingen)
1.2 方法
1.2.1 人外周血T细胞的分离 取健康人外周血5 ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，转入塑料培养皿,于37℃孵育6 h,轻轻晃动培养皿,PBS洗涤3次，弃去上清，黏附在培养皿上的细胞即为单核/巨噬细胞。用EDTA法重悬细胞，锥虫蓝染色法测定收获细胞的活力，以>95%为合格［5］。以FITC-鼠抗人CD14单抗染色细胞，流式检测单核/巨噬细胞的纯度，以>90%为合格［6］。
1.2.2 白藜芦醇干预 将上述细胞密度调整为2×106 L-1，加入24孔板，1 ml/孔，然后加入IFN-γ(终浓度1×105 U/L［5］)，同时分别加入终浓度为0.5，5，25，50和100 μmol/L的白藜芦醇，并设不加白藜芦醇的对照组(白藜芦醇用DMSO溶解，各组DMSO终浓度不超过0.2%)［7,8］，置于37℃、体积分数为0.05CO2培养。
1.2.3 RT-PCR法检查CCR5基因的表达 细胞总RNA的提取：于细胞培养24小时收集细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤1次，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取5 μl RNA进行琼脂糖电泳。
CCR5及内参照GAPDH的合成：CCR5(482 bp) 正义引物 5′-GTGGGCAACATGCTGGTCAT-3′， 反义引物5′-GGCAGGACCAGCCCCAAGAT-3′；GAPDH(639 bp)正义引物5′-AGCTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，反义引物5′-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3′。
RT-PCR法检查CCR5基因的表达:按逆转录试剂盒（TaKaRa）说明书进行。取样本RNA 3 μg，分别加入50 μmol/L Oligo(dt) 1 μg， 0.1 μmol/LDTT 1 μl，40 U/μl RNAase OUT 1 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl、逆转录酶MMLV 1 μl，加RNAase-free H2O至25 μl。PCR反应体系为：模板cDNA 1.5 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，10 mmol／L dNTP 2 μl，10 μmol／L 引物各1 μl及Taq DNA聚合酶0.5 μl，加水至25 μl；于96℃变性5 min，96℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共计25个循环；72℃延伸10 min。取10 μl PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测。
1.2.4 各组单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率检测 于细胞培养24 h后，收集细胞，用PBS（含0.2% BSA和 0.02%叠氮化纳）洗涤２次，弃上清，分别加入鼠抗人CCR5抗体（2.5 μg/ml），同时作同型对照，置4 ℃30 min。用2.5 μg/ml 的FITC-羊抗鼠IgG洗涤并重悬细胞，置4 ℃30 min。PBS洗涤后用300目滤网过滤，然后分别上机应用流式细胞仪检测［9］。
1.2.5 CCR5荧光素酶报告基因（pGL3-Basic-CCR5）转染试验 ①质粒DNA的纯化：将质粒pGL3-Basic-CCR5，pGL3-Basic，pGL3-Control和pSVβ-gal,分别转化细菌，获得转化菌，用质粒大量提取试剂盒按产品说明书提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA纯度（无RNA带为合格），用蛋白核酸分析仪检测质粒DNA含量及纯度［D(260 nm)/D(280 nm)>1.8为合格］。 ②质粒DNA瞬时转染单核/巨噬细胞，按照lipofectamine 2000 Reagent(Promega)产品说明书进行操作。方法为细胞转染次日，EDTA法重悬对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640换液，调整细胞密度为2×105 L-1，加入24孔板中，1 ml/孔。细胞转染前以不完全RPMI1640洗涤每孔2次，每孔加入不含抗生素的完全RPMI1640 1 ml，置于37℃，5%CO2培养备用。取质粒pGL3-Basic-CCR5，pGL3-Basic（阴性对照组）和pGL3-Control（阳性对照组）各1 μg分别混入0.2 μg pSVβ-gal（内参照），分别加入50 μl不完全RPMI1640培养基，分别取脂质体2 μl加入50 μl不完全RPMI1640培养基，置室温5 min，缓慢混合DNA及脂质体稀释液，室温孵育20 min，随后将DNA-脂质体稀释液按照100 μl/孔加入24孔板，轻轻前后晃动培养板使液体混匀，置于37℃，5%CO2培养。③药物干预：转染5 h后各转染组加入IFN-γ(终浓度1×105 U/L)，其中pGL3-Basic-CCR5转染组再加入终浓度为0，0.5，5，25，50和100 μmol/L的白藜芦醇，置于37℃、体积分数为5%CO2继续培养。④荧光素酶相对活性测定：于转染48 h后收集细胞转入1.5 ml EP管，1 000 r/min离心5 min,弃上清，PBS洗涤2次，每管加入200 μl 报告基因细胞裂解液，振荡30 s，置室温5 min，12 000 r/min离心30 s，取20 μl 上清液加入100 μl荧光素混合后立即用荧光分析仪检测光密度值。用β-gal ELISA检测试剂盒及酶标仪检测各组β-半乳糖苷酶活性（D值）。⑤荧光素酶相对活性的方法：荧光酶活性校正值＝荧光素酶光密度值/β-gal D值，荧光素酶相对活性=各组荧光酶活性校正值/pGL3-Basic转染组校正值。
1.2.6 统计学处理 样本PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带的灰度分析采用Band Leader Application Version3.00软件；数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，差异显著性用单因素方差分析(One-Way Anova)和LSD法。
2 结果
2.1 各组单核/巨噬细胞CCR5基因的表达
对照组和白藜芦醇0.5，5，25，50和100 μmol/L 组CCR5/GAPDH（灰度比）均值分别为0.827±0.09,0.812±0.09,0.819±0.09,0.746±0.08,0.710±0.08和0.701±0.08。低浓度白藜芦醇处理(0.5和5 μmol/L)组CCR5 mRNA表达与对照组比较无明显差异(P>0.05)，而中、高浓度白藜芦醇处理(25,50和100 μmol/L)组CCR5 mRNA表达较对照组显著降低(P<0.01)，其CCR5/GAPDH（灰度比）均值分别为对照组的0.88,0.84和0.83倍（P<0.01）（见图1）。
1～6号泳道依次为对照组和白藜芦醇0.5,5,25,50和100 μmol/L 组。M：标准，为100,200,300,400,500和600 bp。RT-PCR产物中MIF扩增产物带为482 bp，GAPDH扩增产物带为630 bp，各孔上样量为5 μl。
图1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测CCR5 RT-PCR产物（略）
Fig 1 RT-PCR products tested by 1.5% agarosegel electrophoresis
A: 对照组 B：RES 0.5μ mol/L组 C：RES 5μmol/L组 D: RES 25 μmol/L组 E：RES 50 μ mol/L组 F：RES 100μmol/L组
图2 单核/巨噬细胞表面CCR5流式检测图（略）
Fig 2 Levels of CCR5 on monocyte/macrophage tested by flow cytometry
2.2 各组单核/巨噬细胞CCR5表达阳性率
对照组、白藜芦醇 0.5,5,25,50和100 μmol/L 组CCR5阳性细胞率（%）分别为76.3±16.8,78.1±17.1,75.7±16.4,66.2±15.0,62.5±14.7和58.9±15.3(图2）。低浓度白藜芦醇（0.5和5 μmol/L）处理组CCR5阳性细胞率与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。中、高浓度白藜芦醇（25,50和100 μmol/L）处理组CCR5阳性细胞率较对照组显著降低（P<0.05），各组CCR5阳性细胞率均值分别比对照组下降了13%,18%和23%（P<0.05）。
2.3 CCR5荧光素酶报告基因转染荧光素酶相对活性
低浓度白藜芦醇（0.5和5 μmol/L）处理组荧光素酶相对活性与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。中、高浓度白藜芦醇（25,50和100 μmol/L）处理组荧光素酶相对活性较对照组显著降低（P<0.05）， 各组荧光素酶相对活性均值分别为对照组的0.84,0.81和0.76倍（P<0.05），见图3。
荧光素酶相对活性
图3 各报告基因转染组荧光素酶相对活性（略）
Fig 3 Results of relative luciferase activity of each transfected group
3 讨论
CCR5是与G蛋白偶联的7次跨膜蛋白，全长包括352个氨基酸，主要表达在单核/巨噬细胞和T细胞表面。CCR5与其主要配体MIP-1, MIP-1β和RANTES结合后, 可激活膜内G蛋白，并引起胞内Ca2+浓度上升及蛋白激酶C的活化，从而表现出白细胞的趋化性及炎症反应等各种生理功能［10］。CCR5还是HIV-1感染单核/巨噬细胞的重要辅助受体。HIV-1首先通过包膜蛋白gp120与单核/巨噬细胞表达的CD4分子结合，随后又与细胞表面的CCR5结合，这种结合诱发gp41插入胞膜，进而病毒进入细胞内［11］。CCR5对于HIV-1感染单核/巨噬细胞是必须的，例如CCR5△32的基因突变个体可抵抗HIV-1的感染，还有很多抗HIV药物的作用机制就是改变CCR5的构象，阻止其与gp120的结合，如TAK-779,SCH-C和E-913等药物［12］。因此单核/巨噬细胞CCR5的表达水平与其对HIV-1的易感染程度是密切相关的。
本实验的结果提示在体外实验中，中、高剂量的白藜芦醇能明显下调单核/巨噬细胞表达CCR5，而CCR5的表达水平又与HIV-1的感染密切相关，因此白藜芦醇抑制单核/巨噬细胞CCR5的表达很可能是其抗HIV-1的机制之一。在HIV-1感染的早期，HIV-1感染的靶细胞主要是单核/巨噬细胞，其后才是CD4+T细胞，所以白藜芦醇在HIV-1早期感染中可能会起到较为明显的作用。另外单核/巨噬细胞还可通过CCR5，接受趋化因子的信号向炎症部位聚集，从而发挥炎症作用，例如2型糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病，与趋化因子和CCR5所介导的单核/巨噬细胞浸润是密切相关的［13,14］。因此白藜芦醇抑制单核/巨噬细胞CCR5表达的作用，可能也是其具有抗炎作用的机制之一。
单核/巨噬细胞CCR5的表达受很多细胞因子的调节，如一定剂量的IL-2,IL-10,PHA,LPS或IFN-γ可上调CCR5的表达，西罗莫司等则可抑制其表达［5,15］。因为未经刺激的人外周血单核/巨噬细胞的CCR5表达水平较低（仅为3%～25%）,难以反映白藜芦醇的抑制作用，因此在本实验中采用IFN-γ（1×105U/L）刺激单核/巨噬细胞表达CCR5,使CCR5细胞阳性率达到了75%以上。本实验CCR5报告基因测定结果显示，中、高浓度白藜芦醇（25,50和100 μmol/L）处理组荧光素酶相对活性较对照组显著降低（P<0.05）， 其荧光素酶相对活性均值分别为对照组的0.76～0.84倍（P<0.05）。这提示中、高浓度的白藜芦醇能够在体外下调单核/巨噬细胞内CCR5启动子的活性，抑制CCR5基因的表达。在CCR5的调控序列中含有Oct-1, TCF-1和GATA1等顺式作用元件，有研究认为细胞因子主要是通过STAT-3-c-Jun/c-Fos途径来引起CCR5启动子的活化［16］。白藜芦醇有可能通过抑制其中某些信号蛋白的活化，起到抑制CCR5转录的作用，具体机制还有待进一步研究。需要指出的是白藜芦醇在体内可形成多种代谢产物如葡萄糖醛酸等［17］， 这决定了白藜芦醇在体内的药理作用要比体外实验更为复杂，因此白藜芦醇的抗HIV或抗炎作用可能是多种机制共同作用的结果。该领域的研究还需要更多的体内实验支持，相信随着研究的深入，白藜芦醇在临床将得到更广泛的应用。
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