人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究
【摘要】 目的： 研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和。方法： 以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs，观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松，维生素C和不同剂量转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖，免疫荧光检测II型胶原，阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果： 体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化，TGF-β1 10 μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论： MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化，转化生长因子β1（TGF-β1）是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素，10 μg/L是其最佳诱导剂量。
【关键词】 骨髓间充质干细胞; 成软骨; 转化生长因子β1
［Abstract］ Objective: To research the phenomenon and rule of multiplication and chondrogenesis of mesenchymal stem cells(MSCs) derived from human bone marrow in vitro. Methods： Healthy adult′s MSCs were isolated from Ilium and purified by density gradient. To observe the conformation, growth and multiplication of MSCs cultured in vitro. We chose the passage 3 MSCs and induced them into chondrogenic differentiation with Dexamethasone，Vitamin C and TGF-β1 in different dosage formed chondracytes induction.After 3 weeks, we measured the sulfate glycosaminoglycan with toluidine blue and alcian blue, type Ⅱ collagen with immunofluorescence and glycosaminoglycan with alcian blue colorimetry. Results： MSCs can be cultured well in vitro. MSCs were induced into chondrocytes by TGF-β1 and TGF-β1 10 μg/L group had the most evident expression. Conclusion： MSCs have strong ability of multiplication and could be induced into chondrocytes under certain circumstances. TGF-β1 is the major factor of chondrogenesis while 10 μg/L is the best inducing dosage.
［Key words］ mesenchymal stem cells; chondrogenesis; TGF-β1
各种由创伤和疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见,目前临床上尚无有效的方法。近年来组织工程技术的给修复关节软骨缺损带来了希望。最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)是修复全层软骨缺损的最佳细胞源［1］。笔者采集健康人骨髓，以密度梯度离心法分离人MSCs，行体外培养扩增及成软骨诱导，希望为临床治疗软骨缺损提供。
1 材料与方法
1.1 对象
骨髓标本取自3名健康成年男性自愿者（28，34，37岁）髂后上棘。3人均无全身性疾病和代谢性疾病。取得知情同意后，无菌条件下抽取骨髓5 ml置于抗凝环境。
1.2 主要试剂
L-DMEM培养基（Gibco公司），类标准胎牛血清（民海生物公司），转化生长因子（TGF）-β1（美国Peprotech公司），维生素C、地塞米松、胰蛋白酶、硫酸软骨素（Sigma公司），人淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物公司），兔抗人二型胶原多克隆抗体、浓缩型Cy3-SABC免疫荧光试剂盒（博士德公司）。
1.3 人MSCs的分离和体外培养
取2.5 ml骨髓加入等量PBS稀释，吹打混匀，贴壁缓慢加入已有5 ml Ficoll分离液的离心管。2 000 r/min离心20 min，吸取界面云雾状白膜层（富含MSCss）。加入PBS,800 r/min离心10 min洗涤2遍，计数。以5×106/cm2接种于细胞培养瓶，加入完全培养基（含10％胎牛血清的L-DMEM培养基）。培养48 h后半量换液，弃去不贴壁的杂细胞。以后2～3 d换液1次，7～10 d即可见较多贴壁细胞。细胞90％融合时0.25％胰酶消化，1∶3传代培养。连续培养三代后MSCs基本纯化。取第三代细胞按1×105/cm2接种96孔板，于传代后8 d内每天取10孔行MTT检测，绘制传代细胞生长曲线。
1.4 成软骨细胞诱导培养
配制成软骨诱导条件培养基①～④号：完全培养基加地塞米松（10-8 mol/L）,TGF-β1 （0， 5， 10， 20 μg/L）、维生素C（10 mmol/L）。取长势良好的第三代MSCs，分4组（命名为A,B,C,D）分别按1×105/cm2接种于含条件培养基①～④号的24孔板（每组12孔）。每日用倒置相差显微镜观察细胞形态。另取4个6孔板，按1×105/cm2接种长势良好的第三代MSCs，分别用条件培养基①～④号诱导培养3周，用以检测蛋白多糖（proteoglycan，PG）含量。
1.5 软骨细胞检测
定向诱导培养3周后，用4%低聚甲醛固定24孔板中细胞20 min后行以下检测。（1）甲苯胺蓝染色：用70%乙醇、浓度为0.2%甲苯胺蓝染色1 min，再以95%的乙醇分色10 min，纯丙酮脱水2次，每次5 min，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。（2）阿利新蓝染色：用pH 2.5的阿利新蓝染色30 min，蒸馏水冲洗15 min，100％乙醇脱水，封固，在倒置相差显微镜下观察染色情况。（3）Ⅱ型胶原免疫荧光：各组取6片细胞玻片用3％过氧化氢作用10 min灭活内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗3遍，每次2 min；滴加山羊血清封闭液，室温10 min；甩去多余液体，滴加兔抗人Ⅱ型胶原IgG一抗，4℃过夜。第2天用PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30 min；PBS洗3次，每次2 min；滴加SABC-Cy3，37℃孵育30 min；PBS洗4次，每次5 min；滴加Hoechst33342，37℃孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；封片，荧光显微镜下观察。（4）PG含量检测：蛋白酶水解6孔板中定向诱导3周后的MSCs，超速离心提取葡萄糖氨基聚糖（glycosaminoglycan，GAG），以蒸馏水为空白对照，硫酸软骨素为标准品，阿利新蓝比色法［2］测定各板每孔GAG总量。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s) 表示,采用t检验分析组间差异。
2 结果
2.1 人MSCs的分离、培养和形态学观察
密度梯度离心法分离的人MSCs接种于培养瓶中时，倒置相差显微镜下可见满视野的小圆形悬浮有核细胞。静置于37℃，5％CO2培养箱中48 h后半量换液，可见有少量贴壁细胞，多为梭形或成纤维细胞样，细胞形态幼小，细短。少数细胞呈扁平多角不规则形态。可见少量克隆样生长细胞，细胞排列不紧密，间距较大。
以后根据细胞营养状态每2～3 d换液1次，细胞数量逐渐增加，细胞间排列逐渐紧密，出现小的细胞集落。部分细胞呈现出典型的长梭形和分支状。培养10 d后细胞间达到90％汇集。消化后按1∶3传代培养。传代培养7 d左右细胞可长满瓶底，细胞间排列紧密，呈漩涡状或编织样排列。连续传三代后细胞形态趋于一致，呈长梭形，细胞两端有长丝状伪足。
2.2 MSCs体外培养扩增的生长趋势
取第三代细胞接种96孔板，在培养的前8 d每天取10孔行MTT检测。生长曲线显示（图1）：接种后的前48 h内，细胞处于潜伏期，无明显增殖，细胞数量及密度变化不大，3 d后细胞开始扩增，3～5 d细胞增长较慢，5 d后扩增速度明显增加，5～7 d细胞数量快速增加，排列逐渐规律，7 d后细胞增殖进入平台期。至8 d已长满孔底，细胞间排列规则紧密，呈编织样、鱼群样排列。
2.3 MSCs成软骨诱导过程中的形态学观察
前5 d细胞形态变化不大，仍保留MSCs典型的长梭形形态，但细胞增殖速度明显较未诱导状态下慢，9 d左右细胞数量约增加1倍。诱导第2周细胞逐渐变得宽大扁平，细胞核变大，胞质丰富，分支增加，有向多角形变化的趋势。后细胞继续向宽大扁平方向发展。
A组于诱导的第13 d出现透亮的圆形空泡状表现，后空泡数量逐渐增多，聚集成团，透亮折光强，形态酷似脂肪细胞（图2）。
图1 MSCs生长曲线（passage 3）（略）
Fig 1 Growth curve of MSCs（passage 3）
图2 A组细胞诱导第18天，空泡团明显（略）
Fig 2 After 18 days of induction, group A has clear vacuoles
2.4 甲苯胺蓝染色结果
A组为阴性胞质不着色。B组胞质染色很淡，无颗粒，细胞核着色，细胞和轮廓清晰。D组胞质染成均一的暗蓝色。C组为强阳性，胞核和胞质均染成深蓝色，细胞质染色更深，细胞轮廓清晰（图3）。
A组为阴性不着色。B组大多数细胞染成淡蓝色，细胞核不明显，少数细胞胞内有深染颗粒。D组细胞核轮廓可以分辨，胞质呈现天蓝色，细胞分支部分染色略淡。C组几乎所有细胞均染成浓蓝色，染色较D组深，细胞和轮廓明显，胞质内可见大块状深染部分（图4）。
2.6 Ⅱ型胶原免疫荧光结果
A组为阴性，B组荧光微弱。C,D两组细胞质中有红色荧光，细胞外也有细颗粒状淡染色荧光区域（图5）。
2.7 GAG含量检测
用标准硫酸软骨素C绘制GAG浓度-光密度（490 nm）标准曲线，求得直线回归方程。根据各孔光密度得到GAG含量。测得4组GAG含量分别为：（1.592±0.171）μg/孔、(5.746±0.344) μg/孔、(13.393±0.621) μg/孔、(11.067±0.407)μg/孔。C,D组高于B组（P<0.01），C组高于D组（P<0.01）。B,C，D组均高于A组（P<0.01）
3 讨论
骨髓间充质干细胞（mesenchchymal stem cells，MSCs）是骨髓中一类来源于中胚层的具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，在不同的诱导条件下可以向脂肪、神经、骨、软骨、心肌、骨骼肌等多方向分化［3-5］。Noble等［6］于1995年首次成功地诱导了MSCs向单一的软骨细胞分化。随后的大量研究也证实了MSCs的体内体外成软骨能力［7,8］。由于MSCs具有来源广泛、取材方便、增殖能力强、分化容易的优点，已经成为软骨组织工程的理想种子细胞。体外培养大量扩增MSCs后成软骨诱导，行自体移植，是关节软骨缺损的理想途径。
TGF-β1对多种细胞的生长和分化都起作用。很早就有实验证实TGF-β1可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞,TGF-β1具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［9］, TGF-β1和其他多种生长因子有协同作用［10］。在本实验中，我们重点研究了不同浓度的TGF-β1对MSCs软骨分化的影响。MSCs在向软骨细胞分化的过程中，随着基因的激活，会合成软骨细胞特有蛋白质产物。其中的Ⅱ型胶原和GAG是细胞外基质中的主要成分，可以作为鉴定软骨细胞的标志物。免疫荧光和细胞染色结果显示使用TGF-β1的B,C,D组的标志物表达明显高于未使用TGF-β1诱导的A组，证实TGF-β1的存在是成软骨分化的关键条件。软骨细胞产物PG的表达强度和TGF-β1的剂量不是线性关系，C组表达明显高于B,D两组，说明10 μg/L可能是促进软骨分化的最佳剂量，过高的剂量可能反而不利于软骨的形成。
近年来关于MSCs软骨分化研究多采用MSCs复合支架的生长方式，研究材料有胶原、聚乳酸、纤维蛋白凝胶、丝素蛋白等［11,12］。支架可以模拟体内软骨细胞生长微环境，为细胞提供三维生长条件，并可为移植提供载体。本实验仍然使用了传统的平面培养方式，结果显示MSCs在平面培养条件下可以发生软骨细胞分化。但在诱导的后期，随着细胞密度增大，细胞间隙变小，可能会限制细胞数量的进一步增加。在人体软骨组织中，软骨细胞存在于软骨细胞陷凹中，软骨细胞合成Ⅱ型胶原和PG并分泌到细胞外基质中，组成细胞外基质的主要成分。本试验染色结果显示发现Ⅱ型胶原和PG多在细胞质中表达，细胞外存在并不明显。这可能也和缺乏支架影响细胞间信号交流、蛋白质难以向较远胞外分泌有关。下一步可以对细胞和支架材料的复合生长情况进一步深入研究。
MSCs具有多向分化潜能，在人工培养条件下如果不添加细胞因子，会发生分化［13］，出现增殖能力下降，失去原有典型长梭形形态，向多分支和多角形。本实验中的A组于诱导第13天出现了空泡状结构，后空泡逐渐增加，形态类似脂肪细胞，而使用TGF-β1的其他组未出现上述现象。提示TGF-β1是维持MSCs定向分化的必要条件。MSCs分化为软骨细胞受到多种复杂因素的影响和调控，其中很多机制目前还不清楚。体外培养条件下需要控制细胞生活条件，选择合适的细胞因子，尽量模拟人体内成软骨环境，构建成熟的MSCs定向分化系统。这对提高成软骨诱导效率，尽量避免非目的方向分化，提高人工软骨移植材料的产量是一个很有意义的课题，值得进一步研究。
软骨组织自身修复能力很差，一旦发生损伤，便会影响关节功能。关节软骨损伤的修复一直是困扰临床医师的难题，目前临床使用的修复方法还存在种种缺陷［14,15］。本实验证实MSCs在TGF-β1的作用下可以向软骨细胞分化，对临床利用自体MSCs修复关节软骨损伤具有指导意义，同时为进一步研究MSCs软骨分化机制奠定了基础。
(本文图3～图5见彩色插图）（略）
【】
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