伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

【摘要】  目的： 为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制，建立该fljB 基因的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）插入变异株。方法： 采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物，用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段，并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果： 经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实，fljB基因中的763 bp被3 550 bp的lacZ片段替代。结论： 成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。

【关键词】  伤寒沙门菌； fljB基因； β-半乳糖苷酶基因； 基因融合

　　［Abstract］  Objective: To study the mechanisms of expressional regulation of fljB∶z66, the fljB∶∶lacZ mutant strain of Salmonella enterica serovar Typhi was constructed. Methods： The mutant strain was prepared by the method of homologous recombination mediated by suicide plasmid. The special primers with KpnⅠ and SalⅠ sites respectively were designed, the upper- and down-stream homologous fragments of the fljB gene were amplified by PCR, a lacZ cassette from the pSV-β-galactosidase vector was linked with the upper- and doun-stream homologous fragments respectively. The resulting product was inserted via SmaⅠ sites into the suicide plasmid pGMB151.S.enterica serovar Typhi were transformed with recombinant plasmid by electroporation transformation, selected in the sucrose plate containing X-Gal. Homologous recombinants were screened by PCR. Results： A 3 550 bp insertion in fljB gene was confirmed instead of  763 bp deletion  by PCR and sequencing analysis.  Conclusion： The mutant with fljB∶∶lacZ have been successfully constructed and it was a foundation to study the expression and regulation mechanism of fljB gene in S. Typhi.

　　［Key words］  Salmonella enterica serovar Typhi; fljB; lacZ; gene fusion

　　伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)是一种具有鞭毛、革兰阴性人类致病菌。鞭毛是沙门菌运动的基础，在其侵袭过程中具有极重要的作用。沙门菌鞭毛素基因的表达受鞭毛调节因子FlhDC和FliA促进，并受环境影响，可由RcsB、PhoP、OmpR等多种中央调节因子参与调节［1-5］。长期以来人们一直认为伤寒沙门菌是单相菌株，1981年Guinee首次在从印度尼西亚分离获得的伤寒沙门菌中发现一种新的鞭毛抗原，命名为z66抗原［6］。2004年黄新祥等首次成功克隆了伤寒沙门菌z66抗原的编码基因［7］。最近研究表明，z66抗原的编码基因属于伤寒沙门菌的二相鞭毛素fljB基因，且位于一罕见的线性质粒中［8］。z66鞭毛抗原的表达调节机制，伤寒沙门菌fljB基因在各种环境下的表达，中央调节因子和鞭毛调节因子对fljB基因表达的影响，这些都迫切需要进一步的研究加以阐明。
 
　　将报告基因插入目的基因以便于观察和分析目的基因的表达水平是研究基因表达调控机制的一种有效手段。为进一步研究z66鞭毛抗原表达调节机制，本研究拟于fljB基因中插入β-半乳糖苷酶报告基因（lacZ），构建相应的插入变异株(fljB∶∶lacZ)。本研究将采用自杀质粒介导的同源重组法，将lacZ报告基因定向插入fljB基因编码区，通过z66基因启动子和SD序列驱动报告基因的表达，为进一步研究fljB基因表达调控机制奠定基础。
 
　　1  材料和方法
 
　　1.1  材料

　　1.1.1  菌株和质粒  大肠杆菌DH5α由本室保存；伤寒沙门菌GIFU10007，大肠埃希菌E.coli SPY372λpir，自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室惠赠；pSV质粒(pSV-β-galactoeidase vector)购自Promega 公司；pMD18-T质粒购自TaKaRa（大连）公司。

　　1.1.2  主要试剂  限制性内切酶 Sma I，Sal I，Kpn I，T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、ExTaq均为TaKaRa（大连）公司产品；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；胶回收试剂盒为Promega公司产品。

　　1.1.3  主要仪器  核酸紫外检测仪（Biophotometer， Eppendorf公司）；PCR仪(ABI2700)；凝胶成像系统（Gene Genius Bioimaging System,SynGene公司）；电转化仪（Gene Pulsero Ⅱ， BioRad公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PCR引物设计  据公布的序列信息，在fljB基因上游和下游设计两对特异的PCR引物P1A/P1B和P2A/P2B（图1），以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出532 bp和 320 bp的同源片段(分别用F1，F2表示)。引物由上海生工生物技术公司合成，序列见表1。
 
　　1～1467为fljB基因的编码区，P1A/P1B,P2A/P2B为该基因上、下游特异性引物。

　　图1  fljB基因上下游同源性片段扩增PCR引物设计（略）

　　Fig 1  Design of primers to amplify the upper- and　down-homologous fragments of the fljB gene

　　表1  fljB基因上下游同源性片段特异性引物序列（略）

　　Tab 1  Specific primers and sequences of the upper-and　down-homologous fragments of the fljB gene

　　1.2.2  重组载体的构建  将pSV质粒用Kpn I和Sal I双酶切，回收3 550 bp无启动子的lacZ基因片段［9］。首先与用Kpn I处理的F1连接lacZ，然后用Sal I处理的F2再与F1-lacZ连接形成F1-lacZ-F2三联体。 将F1-lacZ-F2克隆至pMD18-T质粒，用酚氯仿混合液裂解细菌，离心(12 000 g，10 min)后，取上清用0.7%琼脂糖电泳初步观察克隆。从初选阳性克隆中提取质粒，用Sma I酶切作进一步鉴定。再用Sma  I酶切阳性pMD18-T质粒获得1.5 μg F1-lacZ-F2片段，将其克隆至自杀质粒pGMB151的Sma I位点，并用热休克法转入E.colλ372，同前述裂解筛选法筛选阳性克隆并用Sma I酶切分析鉴定。

　　1.2.3  重组载体电击转化  将GIFU10007 菌在液体LB培养基中培养至对数生长期，制备电击感受态GIFU10007细胞，取2  μg重组自杀质粒与40  μl 的感受态细胞混合后，加到预冷的电极杯中进行电击转化。电击参数：电阻200 Ω，电容25  μF，电压2.4  kV。电击后立即将细胞转到37 ℃预温的SOC营养液中，37 ℃温浴1 h后涂于含氨苄青霉素的LB培养基平板，37℃过夜培养。

　　1.2.4  重组变异株的筛选  由于自杀质粒pGMB151含有氨苄青霉素抗性基因，首先在含氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选抗性菌落，再将氨苄青霉素抗性菌落接种于含5 %蔗糖和X-Gal的LB培养基平板上培养，利用自杀质粒带有的SacB基因特性，诱导细菌脱去质粒及同源重组，能在平板上生长出蓝色的菌落为重组阳性菌落，再利用重组片段与原片段大小的差异，用引物P1A和P2B进行PCR验证重组。将连续3次传代都稳定的完全重组菌作为该fljB基因的lacZ插入变异株。

　　2  结果
 
　　2.1  fljB基因上、下游片段F1、F2的扩增
   
　　以GIFU10007的DNA为模板，用特异性引物P1A/P1B和P2A/P2B进行PCR扩增，获得fljB基因上、下游同源性核苷酸片段F1（532 bp）和F2（320 bp）。
 
　　2.2  无启动子的lacZ基因的获取及与fljB同源片段的连接    用 Kpn I和Sal I双酶切pSV质粒，将回收的lacZ片段用碱性磷酸酶处理。用Kpn I酶切F1后与lacZ连接成F1-lacZ片段，再用 Sal I酶切F2后与F1-lacZ片段连接成F1-lacZ-F2，此即含无启动子lacZ基因的fljB基因同源重组片段(见图2)。
 
　　M: λ-EcoT14Ⅰ digest DNA标准参照物;  A: F1-lacZ片段;  B: F1-lacZ-F2片段

　　图2  lacZ片段与fljB基因上下游片段F1及F2连接（略）

　　Fig 2  Ligation of lacZ fragment with F1 and F2, the upper-and down-stream fragments of the fljB gene.

　　2.3  F1-lacZ-F2进行TA克隆及鉴定
 
　　胶回收Sma I酶切的F1-lacZ-F2片段，用pMD18-T质粒进行TA克隆，用酚/氯仿混合液裂解细菌，初筛阳性克隆（图3），提取初筛阳性克隆的质粒，用Sma I酶切后，结果显示有一约4 400 bp大小的片段，与预期的F1-lacZ-F2片段大小相符。
 
　　1，2，3，4，5，7，8，9泳道为阴性质粒带；第6泳道的片段为可疑阳性片段

　　图3  pMD18-T质粒阳性克隆的初筛（略）

　　Fig 3  Prescreening of the positive clone harboring　the pMD18-T Vector

　　2.4  重组自杀质粒pGMB151的构建及鉴定
 
　　用Sma I酶切阳性pMD18-T质粒并经胶回收F1-lacZ-F2片段，克隆入自杀质粒pGMB151的Sma I位点，用热击法转化E.coli SPY372λpir，涂于含AMP，IPTG，X-Gal的LB平板过夜，取蓝色菌落于液体LB培养基增菌，提取质粒酶切鉴定。结果如图4所示，重组自杀质粒pGMB151构建成功。
 
　　M：λ-EcoT14Ⅰ digest DNA标准参照物;  A：重组自杀质粒用Sma I酶切结果

　　图4  重组自杀质粒酶切鉴定（略）

　　Fig 4  Identification of the recombinant suicide plasmid

　　2.5  重组自杀质粒转化GIFU10007及同源重组菌株的筛选鉴定
  将重组自杀质粒pGMB151通过电击法导入GIFU10007菌株中，并将细菌涂于含氨苄青霉素，X-Gal 的LB平板，取一蓝色菌落接种于1 ml LB中37℃摇床上200 r/min 6 h，10-5稀释后取100 μl 涂于含5 %蔗糖的LB平板,37℃ 过夜。挑取10个菌落（分别编号为1-10）处理后以P1A/P2B 为引物进行PCR，观察重组现象，结果如图5所示，6号菌发生了完全重组，3号，10号菌发生了部分重组，其他则无重组现象。取6号菌连续传代培养，第2，3，4次的筛选结果均很稳定，如图6（第4次筛选结果）所示，所有菌株均为完全重组菌，说明该菌株已成为稳定的变异株。
 
　　M：λ-EcoT14Ⅰ digest DNA 标准参照物;  1，2，4，5，7，8，9泳道为非重组菌PCR结果；3，10泳道为非完全重组菌PCR结果;  6泳道为完全重组菌PCR结果.

　　图5  重组菌的PCR初筛（略）
Fig 5  Prescreening of recombinant strains by PCR

　　M：λ-EcoT14Ⅰ digest DNA标准参照物；1～6泳道为经2，3，4次传代后得到的稳定变异株PCR结果

　　图6  重组菌第4次传代后的PCR观察结果（略）

　　Fig 6  PCR results in recombinant strains after transfer　of culture four times

　　3  讨论
   
　　伤寒沙门菌是一种具有鞭毛、革兰阴性人类致病菌，可造成严重全身性感染“肠热症”。鞭毛在伤寒沙门菌侵袭过程中具有极其重要的作用。伤寒沙门菌与鞭毛结构和功能相关的基因有近50种，主要分布于染色体4个不同的区域［10］。鞭毛从结构上可分为3个部分：基体、弯钩和细丝。基体部被包埋在细菌内外膜中，结构最为复杂，中央有小管。细丝部在菌体外侧通过弯钩部和基体部相连，主要由一种称之为鞭毛素(flagellin)的蛋白质构成。大量的单体鞭毛素蛋白在细菌胞内合成后，经由基体部和弯钩部的中央小管分泌到细胞外侧，以每圈11个单体的螺旋形式由近及远，逐步聚集成细丝。大部分沙门菌含两种不同的鞭毛素编码基因fliC和fljB，位于不同的染色体区域，被称为一、二相鞭毛素基因。最近的研究表明z66阳性伤寒沙门菌属于特殊的两相沙门菌，其二相鞭毛素编码基因fljB不是位于染色体，而是位于一线性质粒，且启动区序列与其他鞭毛启动区不同。fljB基因在不同环境下的表达，中央调节因子和鞭毛调节因子对其表达的影响等，都迫切需要进一步的研究加以揭示。
 
　　分析基因的表达通常从转录和翻译水平进行，由于鞭毛素蛋白合成后需分泌到胞外聚集装配成鞭毛细丝结构，采用一般的分泌蛋白结合Western blot分析方法来观察鞭毛素基因在翻译水平的表达，易受鞭毛素蛋白的分泌和装配等因素的影响。β-半乳糖苷酶能分解X-Gal产生蓝色产物，也可作用于邻硝基苯-β-D 半乳吡喃糖苷产生黄色化合物，可用比色法进行检测, 操作简便、快速且灵敏，因此，β-半乳糖苷酶基因（lacZ）已成为经典的报告基因被广泛应用于分子生物学研究。
 
　　本研究通过体外重组制备含有lacZ基因的伤寒沙门菌fljB基因的同源片段，由自杀质粒介导与伤寒沙门菌线性质粒进行同源重组。研究表明，成功制备了具有β-半乳糖苷酶表达活性的伤寒沙门菌fljB基因的lacZ插入变异株。为使体外重组片段制备顺利，我们在设计和制备中除去了fljB基因编码区部分序列，同时将不含自身启动子的lacZ置于fljB基因的编码区中间，使lacZ基因表达完全受fljB基因表达驱动，成为fljB基因表达的报告基因。
 
　　我们将进一步测定中央调控基因缺失突变株（如rcsB─,phoP─,ompR─）与野生株中β-半乳糖苷酶的活性及在各种应激条件下β-半乳糖苷酶的活性变化，探索fljB基因表达调控机制。

【】
  　　［1］ Macnab RM.Flagella and motility［M］∥Neidhardt FC, Curtiss III R, Ingraham JL,et al. Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology. 2nd ed. Washington DC: ASM Press, 1996: 123-145.

　　［2］ Arricau N, Hermant D, Waxin H,et al. The RcsB-RcsC regulatory system of Salmonella typhi differentially modulates the expression of invasion proteins, flagellin and Vi antigen in response to osmolarity［J］. Mol Microbiol, 1998, 29(3): 835-850.

　　［3］ Adams P, Fowler R, Kinsella N,et al. Proteomic detection of PhoPQ-and acid-mediated repression of Salmonella motility［J］. Proteomics, 2001, 1(4):597-607.

　　［4］ Claret L, Hughes C. Functions of the subunits in the FlhD(2)C(2) transcriptional master regulator of bacterial flagellum biogenesis and swarming［J］. J Mol Biol, 2000, 303(4): 467-478.

　　［5］ Tomoyasu T, Ohkishi T, Ukyo Y, et al. The ClpXP ATP-dependent protease regulates flagellum synthesis in Salmonella enterica serovar Typhimurium［J］. J Bacteriol, 2002, 184(3): 645-653.

　　［6］ Guinee PA, Jansen WH, Mass HM,et al. An unusual H antigen(Z66) in strains of Salmonella typhi［J］. Ann Microbiol(Paris), 1981, 132(3): 331-334.

　　［7］ Huang X, Phung le V, Dejsirilert S, et al. Cloning and Characterization of the gene encoding the z66 antigen of Salmonella enterica serovar Typhi［J］. FEMS Microbiol Lett, 2004, 234(2): 239-246.

　　［8］ Baker S, Hardy J, Sanderson K.E,et al. A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi［J］. PLoS Pathog,2007,3(5):e59.

　　［9］ Brachvogel B, Dikschas J, Moch H, et al.Annexin A5 is not essential for skeletal development［J］. Mol Cell Biol,2003,23(8):2907-2913

　　［10］ Mimori Y, Yamashita1 I, Murata1 K, et al. The Structure of the R-type straight flagellar filament of Salmonella at 9 ? resolution by electron cryomicroscopy［J］. J Mol Biol, 1995, 249(1): 69-87.