鼻咽癌标志物及其检测方法应用的研究进展

【摘要】  本文对鼻咽癌标志物如鼻咽癌相关基因标志物、EB病毒标志物及肿瘤相关物质群等和检测方法的应用作了综述。

【关键词】  鼻咽癌；标志物；EB病毒；检测技术；综述

    鼻咽癌最常见于我国南方，特别是广东为世界最高的发病地区。目前认为其发病与遗传因素、病毒因素及环境因素等有关。由于鼻咽部解剖位置隐蔽，鼻咽癌临床表现复杂多变，早期症状不典型，极易漏、误诊。为了提高鼻咽癌的诊治水平，建立快捷有效的检测方法，寻找能够用于早期诊断、判断预后和观察，且具有高灵敏度和特异性的标志物十分必要。本文就近年来鼻咽癌标志物及其检测方法应用的研究进展作一综述。

    1  鼻咽癌标志物

    1.1  相关基因标志物

    分子生物学研究证实鼻咽癌的发生与多个基因的改变有关，如c-myc、MDM2、P53、Ha-ras在鼻咽部组织中的高表达对鼻咽癌的发生有重要的作用［1］。崔晓波等［2］也发现了多个较高肿瘤特异性的未治基因，有可能作为鼻咽癌的早期诊断标志物。另有报道c-myc和Bcl-2蛋白可作为反映鼻咽癌放疗效果和判断预后的标志物［3］。国内亦有资料列举了可能与鼻咽癌相关的癌基因（TX、NAG23/FBXO30、NAG18、c-erbB-2、met、bcl-2、Her2）和抑癌基因（NP9、ING1、FHIT、UBAP1、NGX6、NAG7、P53、P16、Rb）［4］。这些基因及其表达产物均有可能成为潜在的鼻咽癌标志物。

    由于鼻咽癌的发生是多基因（癌基因、抑癌基因和调控基因）参与的复杂过程，还涉及遗传与环境的相互作用，再加上现阶段检测技术的限制，这些基因标志物的实用性尚需进一步验证。

    1.2  相关EB病毒标志物

    EB病毒已成为研究鼻咽癌病因和相关标志物的重要方面。EB病毒标志物已作为鼻咽癌辅助诊断的重要指标，目前已用于临床的有血清EB病毒壳抗原-免疫球蛋白A（EBVCA-IgA）、EB病毒早期细胞内抗原-免疫球蛋白A（EA-IgA）、EB病毒核抗原-免疫球蛋白A（EBNA-IgA）和EB病毒DNA酶抗体等。同时，还有一些很有利用价值的标志物正在研究和探索中，有望近期应用于临床。

    1.2.1  抗EB病毒特异性胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）抗体  TK是一种催化胸苷磷酸生成胸苷酸的酶，在DNA的合成调控中起重要作用。Connolly等［5］用ELISA法检测人体血清中针对EB病毒编码TK的IgA抗体，证实此抗体是一个良好的鼻咽癌标志物，与EBVCA-IgA和EA-IgA相比，具有更高的检测灵敏度和相似或更高的特异性。近几年的相关报道少见，能否将TK抗体应用于临床尚需进一步验证。

    1.2.2  EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）基因   LMP1基因具有癌基因功能，LMP1与细胞的转化有关，可通过干扰细胞内信号传导途径促进鼻咽癌的发生、和转移。用PCR方法检测鼻咽癌患者脱落细胞中的LMP1基因具有很高的灵敏度和特异度。有报道称联合检测EB病毒基因组LMP1和EBNA诊断鼻咽癌的灵敏度和特异度分别为91.4%和98.3%［6］，监测鼻咽癌复发的灵敏度和特异度可至91.7%和98.6%［7］。随着PCR技术的普及，LMP1基因有望作为一种鼻咽癌标志物应用于临床。

    1.2.3  抗EB病毒编码的Z蛋白（Zebra）抗体和Rta蛋白抗体  Dardari等［8］报道Zebra抗体可作为年轻鼻咽癌患者的生物标记物。任军等［9］通过研究证实：抗Rta-IgG可以作为诊断鼻咽癌的标志物，其若与Zebra抗体检测联合使用，可进一步提高鼻咽癌筛选和诊断的灵敏度或特异度。

    1.2.4  EB病毒的DNA分子  近年来，随着实时PCR（ real-time PCR）技术的推广应用，大量研究证实EB病毒DNA分子是一种良好的鼻咽癌标志物，可以广泛应用于鼻咽癌的早期诊断、预后判断、疗效监测、临床分期等各个方面。有报道认为血浆EB病毒DNA诊断鼻咽癌的灵敏度和特异度可至96%和93%，并可用于鼻咽癌分期、预测以及监测鼻咽癌患者的复发和转移［10］。Leung等［11］报道EB病毒DNA和EBVCA-IgA是检测鼻咽癌最为敏感的外周血标志物，若将两者联合应用则可进一步提高检测的准确性。近几年，国内外关于EB病毒DNA作为鼻咽癌标志物的报道还有很多，基本上都持肯定的态度，随着相关仪器的逐步普及，对EB病毒DNA的检测必将得到进一步的推广。

    1.3  其他相关标志物

    1.3.1  肿瘤相关物质群（TSGF）  TSGF原名恶性肿瘤特异性生长因子，是肿瘤发生和生长过程中肿瘤和周围毛细血管增生时产生的糖类物质、氨基酸及其代谢物质的总称。TSGF检测易受多种因素的影响，主要用于广谱肿瘤的早期筛查。国内报道TSGF在鼻咽癌的早期诊断、疗效观察和预后判断方面具有一定的临床应用价值［12］。

    1.3.2  Cyfra21-1  Cyfra21-1是细胞角蛋白19（CK19）的片段，是一个近年来引起高度关注的肿瘤标致物，对于鳞癌、腺癌和大细胞癌有较高的诊断价值。Cyfra21-1可以作为诊断鼻咽癌的标志物，若与TSGF联合应用，可以提高检测的阳性率［13］。Cyfra21-1也可以用于评估鼻咽癌的预后和监测转移［14-15］。

    1.3.3  细胞因子和黏附分子  近期研究表明多种细胞因子和黏附分子可以作为鼻咽癌的标志物，主要包括IL-4、IL-6、IL-12、TGF-α、TGF-β、INF-γ、sICAM-1、VEGF等。有报道指出IL-4、IL-6、IL-12、TGF-β、INF-γ可以用于鼻咽癌诊断，IL-6还可以用于评估疗效，TGF-α和sICAM-1能用于鼻咽癌预测、判断预后和监测复发等多方面［16-18］。VEGF有希望成为判断鼻咽癌预后的标志物［19-20］。

    1.3.4  CD分子  CD分子是位于细胞膜上的一类分化抗原的总称，CD后的序号代表一个（或一类）分化抗原分子，它们在免疫应答的识别、活化及效应阶段均发挥重要作用。资料显示CD10、CD80、CD86、CD138等CD分子的表达与鼻咽癌的预后密切相关，有可能成为评价其预后和疗效的标志物［21-23］。

    1.3.5  血清唾液酸（SA）  SA是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，与细胞恶变、癌转移、浸润及肿瘤抗原性密切相关。临床常把SA看成广谱肿瘤标志物，与其他标志物结合以提高诊断的灵敏度和特异度。在鼻咽癌研究中，有报道［24］指出SA在鼻咽癌治疗前患者的敏感度高于EBVCA-IgA检测，若两者联合可明显提高鼻咽癌患者的阳性检出率，能用于高危人群的普查和筛选。SA还可能成为鼻咽癌病情变化的动态监测指标［25］。

    1.3.6  血清淀粉样A蛋白（SAA）  William等［26］通过表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术分析，认为SAA能作为监测鼻咽癌复发的标志物。但是Diamandis［27］对此结论表示疑问，认为SAA是一种急性期反应物，对肿瘤缺乏特异性，还不能肯定其可作为肿瘤标志物。故有必要采用炎症等病例作对照进行验证。

    1.3.7  骨桥蛋白（OPN）  骨桥蛋白是一种磷酸化糖蛋白，它能作用于肿瘤转移的多个环节，促进细胞黏附、浸润，促进血管生成和抑制凋亡。Wong 等［28］发现鼻咽癌患者的血浆OPN水平与正常对照组比较，差异具有统计学意义，同时发现OPN水平与晚期鼻咽癌转移密切相关。OPN有希望作为一种监测鼻咽癌发病和转移的标志物应用于临床。

    此外，一些酶类如基质金属蛋白酶（MMP）、乳酸脱氢酶（LD）及其同工酶、端粒酶等与鼻咽癌的相关性也处于积极地探索之中，有可能从中发现有价值的标志物。

    2  鼻咽癌标志物检测方法

    2.1  多种标志物联合检测

    由于大部分单个鼻咽癌标志物的灵敏度或特异度偏低，不能满足临床需要。近年来，理论上和实践上都提倡一次同时测定多个标志物以提高灵敏度或特异度。有文献［11］报道单独检测EBV DNA和EBVCA-IgA诊断鼻咽癌的灵敏度分别为95%和81%，而两者联合检测的灵敏度可达到99%。单独检测EA-IgG和EBNA1-IgA诊断鼻咽癌的特异度分别为87.93% 和84.48%，而两者联合检测的特异度可以达到94.83%［29］。亦有许多学者做了其他鼻咽癌标志物联合检测的尝试，从文献报道来看大都取得了满意的结果［9，24，30-32］。总的看来，根据不同的临床需求可以选取不同性质的鼻咽癌标志物加以组合以达到满意的效果，对于应选取哪些标志物进行组合目前尚无权威的定论，可以相关的文献报道。但是，联合检测的标志物种类不宜过多，一般认为2～4项为宜，以免浪费人力、物力以及增加假阳性的比例。

    2.2  检测技术的应用

    免疫检测法主要采用三大技术：用放射性核素标记抗原或抗体的放射免疫测定（RIA），用酶标记的酶联免疫测定（EIA）和用荧光素标记的荧光免疫测定（FIA）。近年来，随着分子生物学技术的发展，出现了一些新技术，如双向电泳（2-DE）、生物芯片、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）、PCR等，使肿瘤标志物的检测进入分子水平。这些新技术在鼻咽癌标志物的研究中大多得到了应用。

    2.2.1  双向电泳（2-DE）  2-DE是利用蛋白质等电点和分子量不同的特性在两次分离中将复杂蛋白质组分离。它的最大优势在于可以把正常或癌变细胞内数以千计的蛋白质分开，并可以用图像分析软件找出差异蛋白点。而这些差异蛋白包含着肿瘤的特异或早期标志物。Doustjalali等［33］应用此技术发现血浆铜蓝蛋白在鼻咽癌患者中存在着高表达。另有学者［34］建立了人类鼻咽癌双向电泳参考图谱，为鼻咽癌的深入研究打下了基础。

    2.2.2  生物芯片  生物芯片是指通过微、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质及其他生物组分的快速、高效、敏感地处理与分析，现已用于多种肿瘤的检测研究中。在鼻咽癌方面，有学者［35］将cDNA芯片与显微切割技术相结合寻找鼻咽癌分子标志物，也有学者［36］应用蛋白质芯片技术于鉴别与鼻咽癌致病及化疗相关的标志物方面，均取得了一定的成果。

    2.2.3  实时定量PCR（RQ-PCR）技术  RQ-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每个循环变得可见，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。随着此项技术的普及推广，EB病毒DNA检测正在逐步走向临床，广泛应用于鼻咽癌的早期诊断、预后判断、疗效监测、临床分期等各个方面［37-41］。

    2.2.4  表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术  SELDI-TOF-MS是一种新的蛋白质组学研究技术，它集芯片和质谱于一身，可大量快速地筛查肿瘤不同发生阶段的蛋白质表达谱，比较肿瘤细胞与正常细胞间所含蛋白质的差异，从而发现大量有诊断价值的蛋白质肿瘤标志物。该技术的原理是用经过特殊处理的固相支持物或芯片的基质表面选择性地从待测生物样品中捕获配体，经原位清洗和浓缩后，再结合飞行时间质谱技术，对结合的多肽或蛋白质进行分析，因此该技术除具有芯片技术的高度自动化、高通量和质谱技术的高分辨率和高灵敏度的特点外，还具有分离纯化蛋白质的功能，在直接检测血液、尿液、细胞裂解液等方面具有明显优势，现已应用于多种肿瘤的诊断研究中。有学者［42］认为该技术可应用于鼻咽癌的临床分类以帮助制定个性化的治疗方案。Ho等［32］报道此技术与EBNA1-IgA检测相结合诊断鼻咽癌的灵敏度为99%，特异度为96%。虽然目前此技术主要应用于研究工作，但其在鼻咽癌的早期诊断、临床分类、预后判断等方面已显示出广阔的应用前景，随着研究的深入，有望尽快应用于临床。

    3  结语

    目前，鼻咽癌的诊断仍须依据内窥镜和活检组织病理检查，但这些方法具有一定的创伤性，在对广大人群进行筛查时会受到一定的限制。传统的单项血清EB病毒相关抗体检测虽然具有微创、简便的优点，但存在灵敏度或特异度低的不足。因此，如何寻找更有价值的鼻咽癌标志物，如何将现有标志物以最佳组合应用于临床，以及如何推广应用新方法和新检测技术一直是鼻咽癌标志物研究的主要方向。

    近年来，随着检测方法的改进，不仅发现了新一代的标志物，而且大幅度地提高了相关检测的灵敏度和特异度，故鼻咽癌标志物的检测作为一种简便、快捷的检查方法有望尽快应用于鼻咽癌的早期筛查及疗效监测等方面。从研究结果来看，EB病毒DNA检测以及血清EB病毒抗体联合检测最有希望广泛应用于临床。在检测技术方面，基因组学研究技术（如RQ-PCR技术）和蛋白质组学研究技术（如SELDI-TOF-MS技术）有可能对发现鼻咽癌标志物及其应用提供强有力的技术支持。

  

  总之，随着检测新技术、新方法的普及、有价值的新标志物的诞生及标志物的合理、正确、规范化使用，鼻咽癌标志物必将在鼻咽癌的诊治中发挥越来越大的作用。

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