兴地区汉族青少年维生素D受体基因BsmI、Tru9I、ApaI位点多态性分布研究

【摘要】  目的:探讨维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）基因BsmI、Tru9I、ApaI位点多态性的分布情况。方法:随机抽取绍兴地区青少年212名作为研究对象，提取其外周血DNA，利用聚合酶链反应(PCR)、基因测序技术检测VDR基因BsmI、Tru9I、ApaI位点多态性。结果:BsmI位点基因型bb、Bb和BB的频率分布分别为89.62%、8.49%、1.89 %；Tru9I位点基因型TT、Tt和tt的频率分布为61.79%、33.96%、4.25%；ApaI位点基因型aa、Aa和AA的频率分布分别为60.38%、30.38%、8.96%。结论:绍兴地区汉族青少年VDR基因BsmI、Tru9I、ApaI位点具有多态性。

【关键词】  受体 骨化三醇 基因多态性 青少年

    Abstract:  Objective:To investigate the distribution of vitamin D receptor gene BsmI，Tru9I，ApaI site gene polymorphism in adolescent. Methods: Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing technology were performed to analyze the VDR genotype in 212 adolescents in Shaoxing region. Results: The frequency of bb, Bb and BB in the BsmI site were 89.62%, 8.49% and 1.89%, respectively；TT, Tt and tt in the Tru9I site were 61.79%, 33.96% and 4.25%; aa, Aa and AA in the ApaI site were 60.38%, 30.38% and 8.96% respectively. Conclusion: There is gene polymorphism in the vitamin D receptor BsmI，Tru9I and ApaI site in adolescent of Han nationality in shaoxing.

    Key words:  vitamin D receptor; gene polymorphism; adolescents

    人类维生素D受体（Vitamin D receptor，VDR）基因位于12号染色体长臂1区3带上，全长约75 kb，共有11个外显子和数个内含子[1]。VDR在多种组织中均能表达，在细胞内VDR与1，25(OH)2D3激素信号分子结合成激素-受体复合物，该复合物与靶基因特定DNA序列上的激素反应元件结合，从而对结构基因的表达产生调节。因而VDR本质上是一个配体依赖的转录因子，它与1，25(OH)2D3一起在调节机体钙磷代谢、细胞增殖与分化以及免疫功能等方面起重要作用。本研究利用聚合酶链反应（PCR）和基因测序技术对绍兴地区汉族青春发育期少年VDR基因BsmI、Tru9I、ApaI位点的多态性进行分析，旨在探讨VDR基因型频率的分布，为进一步观察其与青少年的生长发育关系打下基础。

    1  对象和方法

    1.1  研究对象  按分层抽样的方法随机抽取212名绍兴地区在校正常学习和生活的青春发育期汉族少年，其中男生90名，女生122名，年龄17～18周岁，平均年龄（17.8±0.5）岁。征得老师与家长同意后，签署知情同意书，抽取全血2～3 ml，采用EDTA-K2抗凝备用。

    1.2  研究方法

    1.2.1  基因组DNA提取：全血提取DNA 试剂盒由杭州晓逸科技有限公司提供。

    1.2.2  PCR 扩增和DNA测序：根据研究需要通过美国NCBI(美国国家生物信息中心)的GeneBank获取VDR基因序列及其相应位点的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息。利用Primer 5.0软件设计引物序列。引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

    含BsmI、Tru9I多态性位点PCR扩增的引物I 序列为：

    P1：5'-ATAAGGAAATACCTACTTTGCTGGTTT-3'

    P2：5'-TAGGTGCTCAATAAATTGTTGCTAAG-3'

    扩增参数为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性60 s，53 ℃复性60 s，72 ℃延伸90 s，重复35个循环；72 ℃延伸10 min。

    含ApaI多态性位点PCR扩增的引物II序列为：

    P1：5'-ACCTAGGTCTGGATCCTAAATGCAC-3'

    P2：5'-GTTAGGTTGGACAGGAGAGAGAATG-3'

    PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸90 s，重复35个循环；72 ℃延伸10 min。

    PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察结果。PCR产物基因序列经纯化后送北京华大基因进行测序。

    1.3  统计学处理方法  各位点等位基因的频率采用直接法，并采用Hardy-Weinberg平衡定律对基因型分布进行检验。

    2 结果

    2.1  PCR及DNA测序结果  针对VDR基因上的3个多态性位点，分别采用两对引物进行扩增，结果由引物I 扩增的片段，包含BsmI、Tru9I多态性位点，长约580 bp；由引物II扩增的片段，包含ApaI多态性位点，长约630 bp（见图1）。

    DNA测序结果显示VDR基因第8内含子的+283位点，即BsmI位点存在碱基C/T多态；第8内含子的+443位点，即Tru9I位点也存在碱基C/T多态；第9外显子的-46位点，即ApaI位点存在碱基C/A多态。基因测序结果见图2～4。

    2.2  VDR基因多态性分布  目前国际上以B/b、A/a、T/t分别表示BsmI、ApaI、Tru9I位点等位基因，B、A、T 表示缺乏内切酶位点，b、a、t 表示存在酶切位点[2]。本次研究结果显示，绍兴地区汉族青少年人群中VDR基因第8内含子BsmI位点碱基为C/C、C/T和T/T，即基因型为bb、Bb和BB的频率分布分别为89.62%、8.49%、1.89%，b、B等位基因频率为93.9%和6.1%；Tru9I位点碱基为C/C、C/T和T/T，即基因型为TT、Tt和tt的频率分布分别为61.79%、33.96%、4.25%，T、t等位基因频率为78.8%和21.2%；ApaI位点碱基为C/C、C/A和A/A，即基因型为aa、Aa、AA的频率分布分别为60.38%、30.38%和8.96%，a、A等位基因频率为75.7%和24.3%。

    2.3  遗传平衡检验  为了检验研究的样本VDR基因型频率是否具有群体代表性，对调查对象的基因型频率进行了Hardy-Weinberg平衡检验。将观察得到的等位基因频率代入基因型的平衡频率(p2， 2pq，q2)，再乘以总人数得到预期基因型分布，然后与实际数进行卡方检验。结果表明，所有基因型的观察值较好地与期望值吻合(均P>0.05)，表明样本具有代表性(见表1)。

    维生素D是人体必需的一种营养素，在体内具有多方面活性，如调节机体钙、磷代谢及组织生长分化，影响机体的生长发育。维生素D的功能主要是通过VDR来介导的，维生素D与VDR结合后，VDR 作用于靶基因，对靶基因的转录和翻译进行调控，进而实现其生物学功能。位于肠道的VDR可增加小肠对钙、磷的吸收。位于肾脏的VDR可增加肾脏近端小管对钙、磷的重吸收。位于骨组织上的VDR的作用则是双向的，位于成骨细胞上的VDR可促进骨桥蛋白、骨钙蛋白的合成，参与骨的形成和矿化；而位于破骨细胞上的VDR可抑制其增殖并促进破骨细胞的分化，促进骨Ca、P的释放。同时VDR可介导1，25(OH)2D3促进胚胎肌肉发育和成熟，在未分化的成肌细胞中，1，25(OH)2D3可刺激DNA的合成并降低肌酸激酶的活性，促进细胞的分化并抑制肌细胞生成；当成肌细胞分化形成肌管后，1，25(OH)2D3则阻止DNA的合成并增加肌酸激酶的活性和肌球蛋白的表达，进而促进肌细胞的生成。

    VDR基因上存在多个多态性位点，目前已发现有FokI、BsmI、ApaI、Tru9I、TaqI和3＇-PolyA多态性。VDR基因多态性在不同种族、不同人群的分布存在差异，本研究就绍兴地区汉族青少年BsmI、ApaI、Tru9I位点的等位基因的频率分布进行分析。

    BsmI、ApaI、Tru9I酶切位点均位于3'端的内含子8[3]，虽然其多态性不影响VDR的氨基酸序列，但目前研究发现这些等位基因多态性与机体的生长发育和许多疾病的发生密切相关[4-6]。近年来国内外有关VDR等位基因频率分布的研究报道表明，VDR等位基因分布因人种不同而有较大差异。在BsmI位点，我国人群B等位基因频率不到10%，与韩国人相似（11%左右），略低于日本人（15%～20%），而在高加索人群中B等位基因频率达35%以上。就基因型而言，我国以bb型较多，达90%以上，Bb 型次之，而BB型不足2%[7-9]。ApaI在我国汉族人群中的分布为A（20%～30%）、a（70%～80%），其基因型分布为AA（4%～10%）、Aa（36%～45%）、aa（50%～60%）[10，11]。而Tru9I位点的基因多态性分布情况国内外报道较少，陈为坚等[12]报道汉族人群TruI基因型频率为TT 69.1%，Tt 25.9%，tt 4.9%。本次研究结果显示绍兴地区汉族青少年VDR基因BsmI、Tru9I、ApaI位点的多态性分布情况与国内其他地区汉族人群VDR基因多态性分布情况基本一致，与同属蒙古人种的韩国、日本分布相近，而与高加索人种比较结果差异较大。说明了VDR基因多态性具有种族差异性，而环境因素对遗传影响可能使同一种族产生不同的基因频率。

    综上所述，绍兴地区汉族青少年VDR基因BsmI、Tru9I、ApaI位点存在多态性，遗传和环境因素可影响其分布频率。

【】
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