NF-κB在腹部火器伤肠管穿透后肝细胞凋亡中的作用

              作者：刘江伟　张永久 李泽信 吕月涛 许永华　闫兵　雷涛 张东

【摘要】  目的：探讨腹部火器伤肠管穿透后NF-κB在肝细胞凋亡信号转导中的作用，了解腹部火器伤肠管穿透后继发性肝损伤机制。方法：健康长白仔猪42头随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12和24 h组，建立腹部火器伤肠管穿透模型，用免疫组化图像分析法测定各组肝内NF-κB活性，观察肝细胞凋亡和肝功能变化情况。结果：伤后各组肝内NF-κB活性明显高于对照组，并于伤后1 h和8 h出现2个高峰（P＜0.05）。肝细胞凋亡指数和血清ALT水平于伤后显著增高（P＜0.05），并与NF-κB活性变化基本一致。结论：腹部火器伤肠管穿透后肝内NF-κB活性增强，肝细胞凋亡增多，导致肝损伤。

【关键词】  NF-κB 腹部损伤 火器 肝细胞凋亡 肝损伤

     Role of NF-κB in hepatocyte apoptosis induced by intestinal perforations due to abdominal firearm wound

    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the role of NF-κB in signal transduction of hepatocyte apoptosis in liver injury. Methods: A total of 42 Chang-Bai piglets were divided into 7 groups: control group, 1, 2, 4, 8, 12, and 24 hours wound group. The model of intestinal perforations due to abdominal firearm wound was established in wound groups. Hepatic NF-κB activity was measured with immunohistochemical staining and image analysis in all groups. Hepatocyte apoptosis indexes and serum ALT levels were also determined. Results: Levels of hepatic NF-κB activity in wounded groups were significantly elevated compared with control group, and there were two peaks （1 and 8 hours group P<0.05）. Hepatocyte apoptosis indexes and serum ALT levels were markedly in creased compared with control group（P<0.05）. All these changes were positive correlation with the changes of hepatic NF-κB activity. Conclusion: After intestinal perforations due to abdominal firearm wound, hepatic NF-κB activity increased and it might induce hepatocyte apoptosis and liver injury.

    【KEY WORDS】 Nuclear factor-κB·Abdominal injuries·Firearm wound ·Hepatocyte apoptosis·Liver injury

    　　NF-κB广泛存在于肝脏各种细胞中，通过调节众多基因的转录参与肝脏的病理生理过程，研究证明NF-κB与肝细胞凋亡关系密切［１］。本研究以已经建立的腹部火器伤肠管穿透模型为基础［２-３］，探讨伤后NF-κB在肝细胞凋亡中的作用，了解腹部枪伤肠穿孔致肝损伤的机制。

    1　材料与方法

    1.1　实验动物及分组　选用解放军63650部队提供的2~3个月龄健康长白仔猪42头，体质量27~33（31.2 ±1.4）kg，雌雄不限。随机分为7组：对照组和伤后1、2、4、8、12和24 h组，每组各6头。

    1.2　枪械参数　军用54式手枪，7.62  mm手枪弹，经专业机构校准：子弹出膛初速度430~435 m/s，弹丸质量5.5 g，撞击能量508.48~520.37 J。

    1.3　环境　在常温环境下致伤，伤后15 min内运回动物实验室，动物实验室温度22 ℃~24 ℃，相对湿度50%~60%。

    1.4　腹部火器伤模型　枪伤前12 h禁食，自由饮水。5%盐酸氯胺酮20 mg/kg + 0.05%硫酸阿托品0.04 mg/kg猪耳后肌内注射麻醉，行走位悬吊于军用靶场门廊上，四肢下垂，完全暴露腹部，于脐水平后方2 cm处右侧腹壁皱襞下缘无毛区标记射击点，专业射手距猪侧腹壁30 cm处瞄准射击点，从右侧腹壁垂直射入，左侧对应位置射出弹头。实验组于伤后相应时间点麻醉开腹，每组动物均取肝左中叶下段肝组织，4% 甲醛固定，常规石蜡切片。对照组除不致伤外，其余步骤与致伤组相同。

    1.5　观察指标

    1.5.1　NF-κB活性检测　按NF-κB/p65免疫组化试剂盒（购自博士德公司）说明操作。参照[4]的方法用Image-pro Plus5.0医学图像分析软件检测每组细胞阳性染色的累积吸光度值，表示NF-κB的活性。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野（×400），检测过程中所有切片的光源强度相同。

    1.5.2　细胞凋亡的原位检测　按TUNEL试剂盒（福建迈新公司）提供的方法进行检测，随机选取5个不重叠的高倍镜视野（×400），BI-2000医学图像分析系统分别拍照。5个高倍视野下的凋亡细胞数，凋亡指数（个/100）=（凋亡细胞总数/细胞总数）×100。

    1.5.3　血清ALT测定　实验各组分别于伤后1、2、4、8、12和24 h时间点抽取猪耳缘静脉血，对照组回实验室后立即抽血，静置30 min后离心，东芝全自动生化分析仪TBA-40FR测血清中ALT水平。

    1.6　统计学处理　实验数据以x±s表示， SPSS 10.0软件包行单因素方差分析，Post Hoc Tests 两两比较，检验水准α=0.05。

    2　结果

    2.1　肝组织NF-κB活性变化　NF-κB染色阳性细胞以肝细胞和枯否细胞为主，正常细胞质有较强的阳性染色，可见黄色和棕黄色颗粒，多数细胞核无明显染色，少数细胞核有一定程度的染色。枪伤后，胞质染色减弱，胞核呈现明显的阳性染色（图1），随伤后时间的延长胞核染色强度逐渐增强。伤后各组NF-κB活性均明显高于对照组（P＜0.05），伤后1 h和8 h出现2个高峰，与伤后肝细胞凋亡及肝功能变化基本一致（表1）。 

    2.2　肝组织细胞凋亡变化　凋亡细胞以肝细胞为主，也有少量枯否细胞和血管内皮细胞，阳性细胞胞核为棕色（图2）。伤后各组肝细胞凋亡指数较对照组有明显增加，伤后各时间点间均有显著差异（P＜0.05），并于伤后2 h和12 h出现2个峰值，第2个高峰值＞第1个高峰值（见表1）。

    2.3　肝功能变化　伤后各组血清ALT水平均高于对照组（P＜0.05），并于伤后2 h和12 h出现2个高峰值。

    3　讨论

    　　胃肠道通过门静脉系统与肝脏联系密切，腹部火器伤肠管穿透后易导致远隔器官肝脏的损伤，并进一步成为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。本研究通过腹部火器伤动物模型观察了肠穿孔后肝脏NF-κB活性和肝细胞凋亡的变化，探讨伤后NF-κB在肝细胞凋亡中的作用，了解腹部火器伤肠管穿透后继发性肝损伤机制，为腹部火器伤后继发性肝损伤和MODS的防治提供实验依据。

    　　在火器伤远达效应发生中，生物释放作用使神经体液因子于伤后10 min、2 h和6~12 h分别存在高峰值，对伤情有重要影响［５］；腹部火器伤后由于枪伤应激、肠穿孔化学性腹膜炎、穿孔周围肠壁挫裂震荡和烧灼坏死，以及肠屏障受损易造成内毒素血症、细菌移位和大量炎症因子入血，从而导致脓毒症。腹部火器伤肠管穿透后的物理、化学、生物释放和感染等因素均可激活NF-κB［６］，共同参与了继发性肝损伤和MODS的发生。本研究发现腹部火器伤肠管穿透后肝组织NF-κB活性明显增加，可能因致伤因素的复杂性和多样性使NF-κB活性于伤后1 h和8 h出现2个高峰，但总的趋势与肝细胞凋亡的变化基本一致，提示NF-κB在伤后致肝细胞凋亡的过程中起着重要作用。这可能与NF-κB过度活化激活多种促凋亡基因表达有关［１］。

    　　与研究所得NF-κB活性、肝细胞凋亡变化曲线相对应的是，伤后ALT水平呈现类似变化，伤后各时间点均增高，并于伤后2 h和12 h出现2个高峰，24 h时仍＞2倍正常值。ALT是检测肝损伤的经典指标，血清中ALT水平升高是肝细胞膜损伤的结果［7］。本研究中血清ALT水平与NF-κB活性和肝细胞凋亡呈现类似变化，提示在接受致伤信号的早期，肝细胞膜在启动下游信号转导活化NF-κB的同时，自身通透性也发生了改变。活化的NF-κB除能调控凋亡相关基因外，还对许多参与免疫和炎症反应的介质基因（如TNF-α、IL-1等）都有诱导调控作用［8］。表达增多的TNF-α等细胞因子在介导肝细胞凋亡、改变细胞膜通透性的同时再次激活NF-κB，使炎症因子释放更多，导致最初的炎症信号进一步放大，从而使肝细胞凋亡不断增加，细胞膜通透性进一步增高，肝损伤恶化［９］。

    　　腹部火器伤肠管穿透后早期肝内NF-κB即被激活，肝细胞凋亡增多、同时肝细胞膜通透性增高，并随着伤后时间的延长而加重。肝细胞凋亡是肝衰竭分子机制中最重要的事件［１０］，NF-κB在此过程中起了关键和核心作用，可能成为极具潜力的新型靶点，为腹部火器伤后继发性肝损伤和MODS的防治提供了新的思路。

    　　致谢：感谢解放军63650部队及解放军546的大力协作。

【】
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