腹腔镜检查与RTＰCR在胃癌诊疗中的临床意义

        作者：张茂修，张光永，汪运山，孙善会，刘杨

　【摘要】目的：探讨进展期胃癌术前腹腔镜检查与RTＰCR检测腹腔灌洗液中游离癌细胞CEAmRNA的表达水平，在胃癌患者术后微转移及预后的临床意义。方法：对52例进展期胃癌患者术前行腹腔镜探查，灭菌生理盐水冲洗腹腔4~５次，收集脱落细胞，进行细胞学检查和RTＰCＲ检测ＣＥＡmRNA表达水平。结果：52例胃癌患者中，细胞形态学检测326％（１７／52）阳性，RTＰＣR检测５５８％（29/52)ＣＥＡmＲＮＡ阳性表达，二者阳性率有显著性差异（P＜005）。结论：诊断性腹腔镜检查、ＲＴＰＣＲ与ＰＬＣ有效结合，可提高腹腔转移复发诊断的灵敏性和特异性，有助于对胃癌分期、淋巴转移和预后的综合判断，对胃癌的辅助提供依据。

　　【关键词】腹腔镜；胃癌；游离癌细胞；ＲＴＰＣＲ
                                                                                    
　　The clinical significance of laparoscopy chol and RTPcr in gastric carcinoma diagnosis and therapy

　　【Abstract】Ｏbjective:To evaluate CEAmRNA expression of peritoneal lavage fluid(PLF)of patients with progressive gastric cancer by laparoscopy and RTPCR before operation, we assess peritoneal metastasis and prognosis after operation Methods:Before operation, we handled 52 patients with progressive gastric cancer by laparoscopy,washing abdominal cavity with 09%NS about 4~5 times,and collected peritoneal free cells detected by cytology and RT-PCRResults:The overall positive rate of cytology was 326%( 17/52),RTPCR positive rate was 558%(29/52);the rate of RTPCR was significantly higher than cytology findings (P < 005)Conclusions:The efficient association of diagnostic LC、RTPCR and PLC(peritoneal lavage cytology)can help improving diagnostic specialty and sensitivity of peritoneal metastasis,synthetically analyzing the relation of stage classification、lymphnode metastasis and prognosis,in order to provide information for further adjuvant therapy

　　【Key words】Laparoscopy；Ｇastric carcinoma;Free cancer cells;RTPCR
                                                          
　　胃癌在我国的患病率和死亡率均居恶性肿瘤前列，手术是最有效的治疗方法，但半数以上的患者术后复发转移，从而导致手术失败。国内外学者研究发现腹腔游离癌细胞（free cancer cells，FCC）在腹腔内形成肉眼或ＨＥ染色均不能发现的微转移灶是胃癌复发的重要原因。Nakanishi等［１］提出侵及浆膜层的肿瘤细胞易于脱落的原因与肿瘤细胞缺乏CD44和βintergin 粘附分子表达有关，IFCCs在腹腔细胞刺激因子作用下，生物活性增高，侵及腹膜下组织形成微小转移灶，致术后转移扩散。本研究首次运用腹腔镜的微创伤性、ＲＴＰCＲ的特异性和灵敏性检测腹腔灌洗液（peritoneal lavage fluid，PLF）中游离癌细胞及其ＣＥＡmRNA表达水平，明确胃癌腹腔转移形成机制，为胃癌的临床诊疗提供依据。

　　1　材料与方法

　　11　试剂与设备                            

　　RTＰCR试剂、琼脂糖、DNA Marker、DEPC 水、Taq 酶购自上海生工；ＣＥＡ（pl5’gagcgaacctcaacctctcctgccact-3’；p2 5’tgtagctgttgcaaatgctttaaggaagaagc３’，367bp)引物由上海博亚合成；ＴＲＩzol试剂购自 Invitrogin 公司;腹腔镜、离心机、5700PCR扩增仪、超低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统。

　　12　方法

　　12１　细胞的收集                             

　　2000年3月至2003年12月山东大学第二行腹腔镜探查的进展期胃癌患者５２例，男42例平均（５６5±62）岁，女10例，平均（60±56）岁，在腹腔镜手术对肿瘤组织进行侵入性操作前行腹腔灌洗，用42℃、300ml灭菌生理盐水冲洗胃床、腹腔等处，尽可能吸取冲洗液，加入ＥＤＴＡ抗凝剂，３ ０００转／分离心10min，弃上清，部分脱落细胞固定ＨＥ染色，由2位细胞学医师盲法随机阅片，做出诊断。另部分沉淀脱落细胞迅速置于超低温冰箱用于mRNA提取。

　　12２　总ＲＮA提取                             

　　Trizol 体系提取总RNA。提取的RNA用01％DEPC水溶解，紫外分光光度仪检测ＲＮＡ样品的OＤ260nm/OＤ280nm比值，得到RNA浓度，然后置于-80℃保存或立即检测。

　　123　ＲＴＰＣＲ                             

　　lug总RNA、lul MMLV、7ul逆转录反应体系、lul antisense primer Pl、去Rnase水补至20ul，快速离心混匀，37℃1h，95℃10min灭活MMLV，快速离心使沉于底部。

　　124　PCR反应                             

　　19ul PCR反应体系、lul Sense primer p2、58ul超净水，快速离心混匀，快速离心均匀，95℃5min，快速离心，使沉于管底，加入2ul（1u/ul）TaqDNA聚合酶，快速离心均匀，加入100ul液体石蜡。循环条件：94℃ lmin、58℃ lmin、72℃lmin，循环35次，末次延长7min。PCR扩增产物2%琼脂糖（含EB05mg/l)DNA电泳。

　　2　结果
                                                           
　　52例各期进展期胃癌患者中，经腹腔镜PLC HE染色细胞形态学检测游离癌细胞326%（17／５２）阳性；RTＰＣＲ检测55８％（29／52）CEAmRNA阳性表达。χ２检验两者检测阳性率存在显著性差异（P＜0025）。

　　３　讨论
                                                           
　　ＰＬＣ检查是一个有用的预测预后的因素，由于该法是检测PLF中FCCs，故敏感性较差。应用ＰLC检测胃癌FCCs的阳性率各家报道不一，诊断腹腔转移的特异性也存在差别，一般认为ＦＣＣs检出率与胃癌浆膜浸润的程度有关。Abe等［２］在77个常规PLC检查阴性的胃癌中，14个（22％）出现腹腔复发，在１７个常规PLC检查阳性胃癌中，只有3个（18％）出现腹腔复发，故认为常规PLC检查并不是一个预测腹腔复发的敏感指标，其估计预后的价值也是有限的。Tokuda等［３］应用常规ＰLC在136例胃癌患者中仅发现ＦＣＣs阳性率为36%。

　　PLC或PLC结合PＬＦ中肿瘤标志物是预测胃癌腹腔复发的有效指标，但是，对PLF中仅有的少量ＦＣＣs而言无能为力，就需采用新的方法加以确认，因为上述实验结果阴性患者仍有部分出现腹腔转移复发。Yonemura等［４］应用ＲＴＰCR技术测定了ＰＬＦ中MMＰ７mRNA表达,结果可检测到样品中10个以下癌细胞，而在间皮细胞、成纤维细胞、外周血和胃良性病变患者腹腔灌洗液中均未检测到ＭＭP7mRNA信号。该法预测腹腔肿瘤播散的敏感性为33％，结合PLC检查可达62％。本组实验检测的各期进展期胃癌患者中，经腹腔镜PLC HE染色细胞形态学检测游离癌细胞326％（17／52）阳性；RTＰCR检测558％（２９/52）ＣＥAmRNA阳性表达，与国外报道基本一致。

　　Fujii等［5］应用ＲＴＰCR和PLC检查了86例胃癌ＰLF中FCCs，结果13个肉眼可见腹腔转移的患者ＣＥＡmRNA均阳性，而24个无浆膜浸润的患者CEA均阴性。在49个肉眼可见浆膜浸润但无腹腔转移的患者中，常规PＬＣ阳性率仅为12％，而RTＰCR CEAmRNA阳性率达55％，在CEA阳性患者中，术后12个月内腹腔复发转移率为５６％，Yonemura等［４］对230个胃癌PLF中CEAmRNA的研究结果表明，PLF中RTPCR CEAmRNA、ＰＬＣ和ＥＬＩＳＡ法测定的CEA水平的阳性率分别为17％、19％和15％。PLC与淋巴结状态、浸润深度和静脉浸润有关，RTPCR ＣＥA 仅与腹腔复发相关，而ＰＬＦ中CEA水平与腹腔复发无相关性。CEARTＰCR预测腹腔复发的敏感性和特异性分别为31％和９５％，准确性达73％。结合PLC检查诊断腹腔复发的敏感性可达57％。

　　Sakakura等［6］应用CEA特异的RTＰCR检测了大网膜乳头的胃癌微转移，结果发现对于判别胃癌腹腔复发，检测大网膜乳头优于PＬＦ。Ueno等［7］和Kodera等［8］应用定量RTPCR检测了胃癌PLF和大网膜中的CEAmRNA表达水平，结果应用CEAmRNA诊断PLF中FCCs的敏感性和特异性分别为77％和9４％，大网膜中的敏感性和特异性分别为46％和90％。多因素分析显示PLF中CEAmRNA表达水平是唯一危险因子，因此认为ＰＬＦ中CＥＡmRNA表达水平可以敏感地预测胃癌患者的腹腔复发，并与淋巴结转移和浆膜浸润有关，而ＰＬＣ则不存在这种相关性。Tokuda等［３］同法测定了136例胃癌ＰLF中CEAmRNA表达水平，结果发现该法的敏感性（２21％）明显高于细胞学检查（36％），CEAmRNA阳性患者的腹腔复发率明显高于阴性患者（P＜00001）。RTＰCR的阳性率随淋巴结转移，淋巴管浸润、肿瘤浸润深度和临床分级的增加而提高。在PLC阴性患者中，ＣＥA阳性患者的生存期明显低于CEA阴性患者（P＜0000１）。

　　Ｒibeiro等［９］对49例进展期胃癌患者进行了术前腹腔镜检查，结果发现只有163％患者存在腹腔转移，而应用ＰＬＣ检查则发现41％患者存在FCCs。在术中无肉眼可见的腹腔转移患者中，29％患者存在IFCCs，且IFCCs只存在浆膜浸润＞３cm２或附近器官和结构被浸润的病例。结果提示，术前腹腔镜检查腹腔转移的效果是有限的，应借助于腹腔镜检查的优势同时进行PLC等检查方能提高诊断IFCCs的敏感性和特异性。

　　PLC已经作为常规技术用于IFCCs检查，对仅有少量FCCs的PLF尚不能做出阳性诊断，故其敏感性较差。因此，应用分子生物学方法RTＰCR检测FCCs成为研究热点，尽管这些方法目前仍处于临床研究阶段,但已经显示出良好的应用前景。如果将快速的RTＰCR技术、PLC检查与诊断性腹腔镜检查有效地结合使用，不但能提高腹腔转移复发诊断的敏感性和特异性，而且有助于对胃癌分期、淋巴转移和预后的综合判断，对胃癌的也有重要的指导意义。

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　　［１］ Nakanish；H,Kodera Y, Toarii A,et alDetection of carcinoembryonic antigenexpressing free tumor cells in peritoneal washes from patients with gastric carcinoma by polymerase chain reaction［J］Jpn J Cancer Res,1997,88:687-692

　　［２］Abe S, Yoshimura H, Tabara H, et alCurative resection of gastric cancer: limitation of peritoneal lavage cytology in predicting the outcome［J］J Surg  Oncol,1995,59(4): 226-229.

　　［3］Tokuda K,Natsugoe S, Nakajo A, et alClinical significance of CEAmRNA expression in peritoneal lavage fluid from patients with gastric cancer［J］. Int J Mol Med,2003,11(1): 79-84

　　［4］Yonemura Y, Endou Y,Fujimura T, et alDiagnostic value of preoperative RTPCRbased screening method to detect carcinoembryonic antigenexpressing free cancer cells in the peritoneal cavity from patients with gastric cancer［J］.ANZ J Surg,2001,71(9):521-528

　　［5］Fujii S,kitayama J,kaisaki S, et alCarcinoembryonic antigen mRNA in abdominal cavity as a useful predictor of peritoneal recurrence of gastric cancer with serosal exposure［J］J Exp Clin Cancer Res, 2002,21(4):547-553

　　［6］Sakakura C，Hagiwara A, Shirasu M,et al Polymerase chain reaction for detection of carcinoembryonic antigenexpressing  tumor cells on milky spots of the greater omentum in gastric cancer patients:a pilot study［J］Int J Cancer,2001,95(5):286-289.

　　［7］ Ueno H, Yoshida K, Hirai T, et alQuantitative detection of carcinoembryonic antigen messenger RNA in the peritoneal cavity of gastric cancer patients by realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction［J］Anticancer Res,2003,23(2C):1701-1708

　　［8］Kodera Y,Nakanishi H, ito S, et alQuantitative detection of disseminated cancer cells in the greater omentum of gastric carcinoma patients with realtime RTPCR: a comparison with peritoneal lavage cytology［J］Gastric Cancer,2002,5(2):69-76

　　［9］Ribeiro U Jr,GamaRodrigues JJ,Bitelman B,et alValue of peritoneal lavage cytology during laparoscopic staging of patients with gastric carcinoma［J］Surg Laparosc Endosc,1998,8(2):132-135