高场强电磁脉冲对Jurkat细胞IFN?γ和IL?4蛋白表达的定量分析

                   作者：金华 王德文 唐晓敏 郑引焕 彭瑞云 

【摘要】  目的 研究电磁脉冲（EMP）辐照对白血病肿瘤细胞株Jurkat细胞分泌细胞因子IFN?γ和IL?4的影响，探讨EMP对Jurkat细胞损伤机制。方法 Jurkat细胞经EMP辐照后即刻、1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共7个时相点，细胞悬液甩片,4%多聚甲醛4℃固定,晾干，进行SP法的IFN?γ和IL?4蛋白免疫组化染色。在光镜10×40倍视野下，应用CMIAS?H图像分析仪对阳性细胞的图像学参数的积分光密度值（IOD）进行测量和统计分析。结果 免疫组化结果表明，场强6×104 V/ｍ的电磁脉冲能使Jurkat细胞IFN?r表达持续性减少，差异非常显著（P＜0.01），而IL?4变化不明显（P＞0.05）。结论 EMP辐照后Th1型的细胞因子IFN?γ明显减少，而Th2型的细胞因子IL?4未见显著变化，提示EMP辐照后机体中受到影响的主要是细胞免疫，而体液免疫功能未受到明显影响。

【关键词】  电磁脉冲； Jurkat细胞； 细胞因子; 体视学分析

    Abstract: Objective  With observing the changes of expression of IFN?γ and IL?4 in Jurkat cell after being exposure to electromagnetic to explore the possible injury mechanism. Methods  The Jurkat cell were collected.at.instantly,1  h, 6  h,12  h,24  h,48  h,72  h respectively after exposure to EMP. The expression of IFN?γ and IL?4 in Jurkat cells were determined by immunohistochemical SP method. stereological analysis for over 100.cells on the glass slide were performed by CMTAS?Ⅱ image analysis system at a magnification 400. ALL data was analyzed by SPSS8.0 software. The significance of differences among groups was analyzed with mono?factor analysis of variance. Results  IL?4 has not statistically change but IFN?r both has decreased. statistically . Conclusion  cell mediated immunity maybe plays an important role in the injury of Jurkat cell by EMP.

    Key words: electromagnetic pulse; Jurkat cell; cytokine； stereological analysis

    电磁脉冲（electromagnetic pulse，EMP）是一种宽频、高能的电磁辐射，在日常生活和特殊时期（如战争时期）均能接触到，对其生物学效应的研究虽早已开展，但大多集中于神经系统的研究。近年来，EMP对免疫系统生物效应的研究日益受到关注［1,2］。笔者利用高场强的电磁脉冲发生器，经场强6×104 V/ｍ对Jurkat细胞进行照射，分别在即刻、1  h、6  h、12  h、24  h、48  h进行免疫组织化学检测，探讨辐照后Jurkat细胞分泌细胞因子IFN?γ和IL?4功能的变化，旨在为进一步阐明EMP作用于免疫系统的机制奠定基础。

 
    1  材料与方法

　　1.1  材料    RPMI1640为Sigma公司产品。小牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品。兔抗IFN?γIgG和兔抗IL?4IgG（一抗）及SP系列试剂盒［包括封闭用正常山羊血清、生物素标记的羊抗兔IgG（二抗）、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素IgG（三抗）及DAB工作液］，均购自武汉博士德生物技术有限公司。CMIAS?Ⅱ真彩色图像分析仪为北京航空航天大学的产品。

    1.2  细胞培养

    Jurkat细胞由本院基础研究所郭宁教授惠赠。应用含10％灭活小牛血清RPMI?1640培养液，在含8％CO2、37℃条件下培养。

    1.3  照射方法

    生物医学研究用高场强电磁脉冲源由国防科技大学院研制，脉冲上升时间20  ns，脉宽30  μs，2分钟内5次，频率包含0—100  MHz，场强6×104 V/m。

    1.4  免疫组化法测定IL?4和IFN?γ

    于辐照后即刻、1  h、6  h、12  h、24  h、48  h、72  h细胞甩片(细胞浓度>106/ml),1200转,1分钟,4%多聚甲醛4℃固定10分钟,自然晾干后4℃保存备用;免疫组化具体步骤入下:

    1. 4℃取出后复温20分钟；

    2. 100％→95％→90％→80％→70％梯度酒精，每种浓度1分钟，蒸馏水5分钟；

    3. TBS浸洗5分钟×3；

    4. 10%H2O2?TBS室温，暗视野，15分钟；

    5. 蒸馏水冲洗两遍，TBS浸洗5分钟×3；

    6. 0.1%胰酶消化5分钟;

    7. TBS浸洗5分钟×3；

    8. 1％Triton?枸橼酸钠冰浴5分钟

    9. 蒸馏水冲洗10次，TBS浸洗5分钟×3；

    10. 加一抗：兔抗IL?4/IFN?r，1：100，湿盒内37℃1小时，4℃过夜；

    11. 复温，室温，10分钟；

    12. TBS浸洗5分钟×3；

    13. 加二抗：生物素化山羊抗兔IgG，1：200，37℃，作用45分钟；

    14. TBS浸洗5分钟×3；

    15. 加三抗：HRP?SA，1：200，37℃，作用45分钟；

    16. TBS浸洗5分钟×3；

    17. DAB显色，室温避光，2—5分钟，自来水冲洗终止反应；

    18. Harris苏木素复染胞核，镜检，1％盐酸酒精适度分化；

    19. 常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；

    对照设置：用TBS代替一抗作阴性对照，其余步骤同上。

    1.5  图像分析

    每组各选3张细胞甩片，用CMIAS?Ⅱ图像分析仪在光镜400倍视野下，随即对每张甩片上100个以上的细胞进行图像学参数——积分光密度（integrated optical density,IOD）测定。最后结果经Spss8.0统计软件进行分析，各组间均值比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    经免疫组织化学SP法染色， IFN?γ染为棕黄色，位于细胞浆内，细胞核为蓝色，对照组IFN?γ反应呈强阳性，辐照组呈弱阳性（图1、图2）； IL?4也染为棕黄色，位于细胞浆内，细胞核为蓝色，对照组IL?4反应呈阳性，辐照组阳性反应程度与对照组相近（图3、图4）。

    经图像分析仪测量，对照组和辐照组于辐照后不同时间 Jurkat细胞中IFN?γ和IL?4蛋白表达的IOD值列于表1和图5、图6。图1  IFN?γ对照组， SP ×400 表1  Jurkat细胞EMP辐照后IFN?γ和IL?4蛋白表达量IOD值变化 注： ** P<0.01,vs control group.    如表1和图5、图6所示，经场强6×104 V/ｍ电磁脉冲辐照后,Jurkat细胞中IFN?γ表达量呈持续性减少，且具有非常显著性差异（P＜0.01），于24  h 达到最低值，48  h呈恢复趋势；IL?4表达量略有减少，统计学未见明显差异（P＞0.05）。

    3  讨论

    电磁波辐射与噪音、白色污染目前已成为文明的三大污染源。流行病学调查发现，长期接受电磁波辐射的职业暴露者可引起神经系统、心血管系统、内分泌系统及免疫系统的结构损伤和功能紊乱。在电磁辐射研究领域中，神经系统尤其中枢神经系统（脑）一直被认为是电磁辐射的高度敏感系统，因此绝大部分研究围绕着中枢神经系统进行［3］，其他系统或脏器较少涉及。根据流行病学调查结果，在高强度电磁辐射区域，脑部肿瘤和淋巴造血性疾病发病率的增加使人们除了继续对中枢神经系统高度关注外，免疫系统对电磁辐射的反应也已逐渐成为近几年的研究热点［4,5］。本文就电磁脉冲（EMP）照射后白血病肿瘤细胞株Jurkat细胞分泌细胞因子的变化进行了观察检测，以期为阐明EMP对免疫系统的损伤机制提供实验依据。

    T淋巴细胞介导细胞免疫应答［6］，并在机体针对TD抗原的体液免疫中发挥重要作用。根据TCR双肽链的构成不同，T淋巴细胞可分为表达TCRαβ的T细胞（αβT，TCR?2细胞）和表达TCRγδ的T细胞（γδT，TCR?1T细胞）；其次，根据αβT细胞的功能特点，可分为辅助性T细胞（Th）、细胞毒性T细胞（Tc）、迟发性超敏反应T细胞（TDTH）等；此外，根据T细胞表面表达CD＋4分子或CD＋8分子,可分为CD＋4或CD＋8T细胞，而CD＋8T细胞一般是指细胞毒性T细胞（Tc），CD＋4T细胞一般是指辅助性T细胞（Th）、迟发性超敏反应T细胞（TDTH）；1986年，Mosmann和Coffman等首先根据长期培养的小鼠CD＋4T细胞分泌细胞因子的格局和介导免疫功能的不同，将其分为Th1和Th2两个亚群。1991年Romagnani等发现人类也存在Th1和Th2亚群。近年来，越来越多的研究证实，Th1和Th2在介导机体免疫应答中扮演着不同角色，这两个亚群的平衡状态与免疫相关疾病的转归和预后密切相关。因此，目前对Th1和Th2的研究，无论在基础免疫还是临床免疫方面都十分迅速。研究结果已基本明确，Th1主要分泌IFN?γ、IL?2、IL?12和TNF?β／α等细胞因子，主要参与细胞免疫，介导与细胞毒和迟发型超敏性炎症有关的应答，故Th1细胞亦称为炎症性T细胞，并被视为相当于TDTH细胞，在抗胞内病原体感染中发挥重要作用。在胞内感染时，Th1细胞优先发育并引发巨噬细胞介导的宿主防御应答。其持续性强应答可能与器官特异性自身免疫病、接触性皮炎、不明原因的慢性炎症性疾病、迟发超敏型反应性疾病、急性同种异体移植排斥反应等的发生有关。 Th2细胞主要分泌IL?4、IL?5、IL?6、IL?10和IL?13等细胞因子，它的主要功能为辅助体液免疫应答，刺激B细胞增殖并产生抗体，参与对蠕虫感染和环境变应原的应答，在遗传易感的过敏性特应症中可能起重要作用。本文所用的Jurkat细胞是一种T淋巴细胞白血病细胞，具有成熟的T辅助淋巴细胞的表型特征，因此，国内外均常采用该细胞为模型研究T淋巴细胞功能及免疫调节机制等。本实验利用Jurkat细胞研究EMP照射后T淋巴细胞功能的变化，为进一步探讨EMP作用于免疫系统的机制奠定基础。

    本实验细胞甩片免疫组织化学研究结果表明，EMP辐照后Th2型的细胞因子IL?4未见显著变化（P＞0.05），而Th1型的细胞因子IFN?γ则持续性非常显著减少（P＜0.01），提示EMP辐照后，机体中受到影响的主要是细胞免疫，而体液免疫功能较少或未受到明显影响。在EMP辐照后机体免疫应答中何以细胞免疫易受到影响而并非体液免疫功能受到影响，初步认为可能与细胞因子作用和产生的信号转导过程中发生了变化有关，其具体机理有待进一步探讨。

【】
  ［1］王德文.现代军事病 ［M］.军事医学出版社,北京: 2002, 236-249.

　　［2］郭鹞,陈景藻：电磁辐射生物效应及其医学应用 ［M］.第四军医大学出版社,西安:2001,70-72.

　　［3］赵梅兰，王德文，马强，等．电磁脉冲对大鼠学习记忆能力和LTP的影响 ［J］．中华物理医学与康复杂志，2001,23(2):69-71.

　　［4］Macri M A, Di Luzio S, Di Luzio S .et al. Biological effects of electromagnetic fields ［J］. Int J Immunopathol Pharmacol, 2002， 15(2):95-105.

　　［5］Boscol P, Di Sciascio M B, D?Ostilio S, Del Signore A, Reale M, Conti P,Bavazzano P, Paganelli R, Di Gioacchino M. Effects of electromagnetic fields produced by radiotelevision broadcasting stations on the immune system of women ［J］. Sci Total Environ, 2001, 12, 273(1-3):1-10.

　　［6］龚非力.医学免疫学［M］.科学出版社, 北京:2003, 101-109.