两种染色方法在细胞核DNA含量检测中的应用及比较

           作者：焦红丽， 冶亚平 夏潮涌   

【摘要】  目的 探讨改良、快速两种Feulgen染色方法达到最佳染色效果的水解时间段，为科研和临床的应用提供方法学指导。方法 选取5只成年健康雄性SD大鼠的肝组织，制成肝细胞涂片，分别在室温和60℃温度下水解不同时间，应用改良和快速两种方法染色，TIGER图像分析仪检测和分析单个肝细胞核的DNA含量。结果 （1） 不同大鼠肝细胞涂片在同一水解温度、时间作用下，相同DNA倍体含量肝细胞的DNA含量大致相同，CV值均小于10%；（2） 二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均接近2或4；（3） 同一大鼠相同水解温度不同水解时间，同一倍体的肝细胞核DNA含量存在差异：60℃水解温度下，IOD(5～7 min)>IOD(9～15 min)>IOD(1 min，20 min)，室温水解温度下，IOD(50 min)>IOD(20～30 min，70～90 min)>IOD(5～1 min，100 min)。结论 HCL水解肝细胞涂片时间过长或过短均不能理想的染色，快速法和改良法Feulgen染色达较佳染色效果的时间段分别为：快速法5～7 min，改良法20～90 min。

【关键词】  DNA分析； 染色与标记方法； Feulgen染色； 肝细胞涂片

    Application and comparison of two kinds of staining methods for

    Abstract: Objective  To find out the suitable hydrolysis time for two staining methods of Feulgen and to provide guidline on research and clinic. Methods  Smears of liver cell suspension were obtained from five healthy rats. All the hepatocytes are, respectively, hydrolyzed in different time at room temperature and 60℃, and then stained with modified Feulgen stain and quick one. DNA content and ploid of intact hepatocyte nuclei was analyzed by TIGER cell image analysis system. Results  (1) the nuclear DNA contents are almost identical from same DNA content ploidy of different rats under the same temperature and time of hydrolysis, and the CV of IOD from three types of DNA content ploidy was less than 10 percent. (2) The IOD ratio among diploid, tetraploid and octaploid was close to 2 and 4. (3) The DNA contents of hepatocyte nuclei from same DNA content ploidy of different rats were distinct under the same temperature and different hydrolysis time: hydrolysis at 60℃, IOD(5～7 min)>IOD(9～15 min)>IOD(1 min，20 min); hydrolysis at room temperature, IOD(50 min)>IOD(20～30 min，70～90 min)>IOD(5～10 min，100 min). Conclusion  nuclei DNA can?t be stained better for extra long or short hydrolysis time, the better hydrolysis time of quick Feulgen stain and modified one are, respectively, 5～7 min and 20～90 min.

    Key words: DNA analysis; staining and labeling methods; feulgen staining; smear

    细胞核的DNA含量测量与倍体分析对判断肿瘤的良恶性及预后有重要价值［1～4］。自1924年Feulgen和Rossenbeck［5］在组织原位上用Feulgen反应显示细胞核的DNA以来，Feulgen反应已广泛应用于生物医学、药学等学科中的细胞、组织化学染色。几十年来，科研工作者们一直从多个角度探索Feulgen反应的最佳反应条件［6～9］，以更好地适应不同的应用要求。目前，临床和科研中普遍采用改良Feulgen染色法，该方法相比传统法效果更为稳定，为适应临床上快速染色、诊断的要求，金日男等［10］改进了染色的过程，提出了快速Feulgen染色法，从而基本满足了临床快速病理诊断的需要。然而，该两种染色方法在具体应用中受到一定的条件限制，同时染色效果也有所差别。本文比较两种染色方法在不同温度、不同时间水解从而寻找改良和快速Feulgen染色法的最适盐酸水解时间，为临床和科研的应用提供参照。

    1  材料与方法

　　1.1  制片    正常雄性SD大白鼠五只，水合氯醛麻醉、开腹，生理盐水经门静脉灌注冲洗肝脏，将其游离并切成约0.5  cm×0.5  cm×0.5  cm的组织块，放于筛网中研磨，刮取白色较黏稠的肝细胞悬液，均匀推于另一载玻片上，每只大鼠制片约30张，4%多聚甲醛固定30  min，干燥保存。

    1.2  快速Feulgen染色

    5N HCl和Schiff′s试剂放入60℃的恒温箱中预热30  min，每只大鼠取八张涂片，入5N HCl（60℃）分别水解不同时间（表1）后再放入Schiff?s试剂中60℃恒温染色10  min，自来水冲洗，乙醇脱水封片。

    1.3  改良法Feulgen染色

     每只大鼠取九张涂片，入5N HCl（室温）分别水解不同时间(表1)后入Schiff?s试剂中室温（23～28℃）染色60  min，自来水冲洗，乙醇脱水封片。

    1.4  图像分析仪的校正与肝细胞核参数的测量

    显微测微台尺（最小刻度10  μm）标定TIGER细胞图像分析仪的几何标尺，计量院出产的标准密度片(DV?24,鉴定证书，光字第1?84041号)标定其光密度值；按柯勒照明要求调整NIKON55i显微镜光源，在物镜(20×NA0.5)与黑白摄像机之间插入535   nm/35 的带通滤光片，按TIGER细胞图像分析仪测量光密度的要求校正系统基准，随机（涂片中部每间隔一视野摄取一帧图像）摄取涂片的聚焦图像(每只大鼠不少于10帧，512×512分辨率，细胞核总数不少于500个)，分别测量2c、4c、8c肝细胞核的面积积分光密度(IOD)、平均光密度(AOD)和面积(At)参数并其变异系数(CV)值，以IOD均值作为各倍体细胞核DNA含量的代表值。CV为标准差(s)与均值(x)之比，用百分数表示，公式为CV=×100%。

    2  结果

    每只大鼠制得的肝细胞涂片经不同的水解时间，两种方法分别染色，室温水解20～90  min涂片、60℃水解5～7  min涂片内肝细胞单个核分布均匀，轮廓清晰，呈紫红色（图1，3）；改良法染色组中，水解5  min、10  min、100  min 的涂片，快速法染色组中，水解1  min、3  min、11  min、15  min、20  min的涂片细胞核染色明显变浅，轮廓不清，染色效果呈现明显差异（图2，4）。

    肝细胞涂片分别在室温、60℃条件下水解不同时间，采用改良和快速法Feulgen染色后，分析涂片内2c、4c、8c 肝细胞核的DNA含量均值、CV值及各DNA含量倍体肝细胞核DNA含量均值间的比值。图5，6显示两种染色方法不同水解时间测得的IOD变化曲线。结果显示，经不同水解时间、相同染色时间染色后，5只大鼠多数能测量出DNA含量为2c、4c和8c的肝细胞核(其中一只大鼠未测到8c细胞核)；不同大鼠同一种方法染色的相同DNA含量倍体肝细胞核经过相同水解时间测得DNA含量均值相近，CV<10%。不同水解时间的同一大鼠相同DNA含量倍体肝细胞核的DNA含量均值，采用单因素方差分析，快速法F =5.177，P =0.001；改良法F =5.041, P =0.000。按α＝0.05判别认为差异有统计学意义。60℃水解温度下，IOD(5～7  min)>IOD(9～15  min)>IOD(1  min，20  min);室温水解温度下，IOD(50  min)>IOD(20～30  min，70～90  min)>IOD(5～10  min，100  min)，两种Feulgen染色法所测得各DNA含量倍体之间的IOD比值均接近于2或4，呈明显的倍数关系。 表1  两种染色方法水解时间 图7～图10是两种Feulgen染色方法测得的单个肝细胞核AOD和At随水解时间变化曲线， 结果显示，不同倍体肝细胞核AOD随时间的延长而发生变化，而At无明显改变。

    3  讨论

      目前，Feulgen反应是应用于图像分析系统中分析细胞核DNA 含量的主要染色方法［11］，然而，传统的Feulgen 染色因操作时间较长且染色效果较改良和快速法较差，已基本为改良的Feulgen染色法所替代；为适应临床快速病理诊断的需要，金日南等提出的快速Feulgen染色法极大地缩短了染色时间，达到了较好的染色效果。

    Feulgen反应的原理是盐酸将DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的糖苷键断开，暴露出DNA链上的醛基与Schiff?s试剂以共价键结合，使细胞核DNA显紫红色。严格地讲，Feulgen反应不是染色过程（虽然Schiff?s试剂是一种染料），它是一种特殊的细胞化学反应［12］，其中盐酸水解是影响Feulgen染色的关键因素。

    由于HCL在水解过程中具有两方面作用［13，14］，即使细胞核DNA产生游离醛基成为无嘌呤核酸(APA) 和将大分子APA解聚成小片断游离出细胞核，被HCL溶解。游离醛基的产生可以导致染色强度(AOD)增加，而APA小片断的产生导致与Schiff?s试剂反应物质的量减少，染色强度降低，因此，水解时间过长或过短均不能很好染色，本文图2、图4与图1、图3呈现的明显差异即由水解时间的影响所致。本文结果显示，两种染色方法都存在染色效果较佳的水解时间段：改良法为20～90  min，50  min为最佳水解时间，即IOD(50  min)>IOD(20～30  min，70～90  min)>IOD(5～10  min，100  min)；快速法为5～7  min，即IOD(5～7  min)>IOD(9～15  min)>IOD(1  min，20  min)。统计学分析差别有显著性（P<0.05）。

    根据国内、外报道，Feulgen染色法的染色效果与反应的温度、碱性品红的质量以及Schiff?s试剂的反复使用次数［12］密切相关。实践中，我们也注意到快速Feulgen染色法由于平台期很短（图9），需严格控制实验的条件，尤其是反应的温度和时间，必须规范化自身的实验条件，同时组织类型、固定液的种类、酸解液的浓度等因素［15］都要严格控制。相比之下，改良Feulgen染色法的平台期很长，染色效果亦较为稳定，更适用于科研工作；但改良法染色过程需要近两个小时，不能满足临床上快速诊断的需要，快速法则极大地缩短了染色的时间，为DNA 含量分析辅助快速病理诊断的应用提供了可能。

    综上所述，Feulgen反应中盐酸水解作用对染色的效果起着非常重要和关键的作用，两种Feulgen染色方法具有各自的优劣势，其各自的稳定反应时间段为应用者根据各自的需要选用合适的染色方法提供了有价值的。

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