ABCG2在肺癌中表达的定量研究

【摘要】  目的 观察ABCG2在肺癌和癌周肺组织的表达，从量化角度阐明其在肺癌组织中表达的病意义。方法 常规石蜡包埋、HE切片确诊，用免疫组化SP法检测ABCG2在肺癌和癌周肺组织的定位和表达，用LeicaQ500MC图像分析系统对其表达强度进行定量分析，并用表达的阳性单位（positive unit PU）反映其表达强度。结果 ABCG2蛋白在肺癌和癌周正常肺组织中的表达主要定位在细胞质和细胞膜。在癌周正常肺组织的支气管和细支气管上皮呈弥漫表达，腺上皮呈灶性表达；肺鳞癌和肺腺癌弥漫或大片表达，肺鳞癌表达的PU值高于肺腺癌(P<0.001)，肺大细胞癌和肺小细胞癌不表达，PU值接近于零。癌周肺组织表达的PU值高于各型肺癌（P<0.05）。ABCG2蛋白表达的PU值在肺癌原发灶和转移灶之间无差别（P>0.05），且与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期未见明显相关性（P>0.05），与肺癌分化程度有关（P<0.001）。分化程度越高，PU值越高，但高分化肺癌和癌周肺组织的表达PU值差异无显著性（P>0.05）。结论 ABCG2蛋白表达程度与肺癌类型及分化程度具有相关性，可能成为判断其指标之一。

【关键词】  肺癌; ABCG2/BCRP/MXR/ABCP; 免疫组化; 定量分析

    Abstract: Objective  To observe the expressions of ABCG2 in lung carcinoma and the normal lung tissue around it and to clarify the significance in lung carcinogenesis. Methods  ABCG2 protein expression was detected by immunohistochemistry (SP method) using the monoclonal antibody and its intensity was assessed Quantitative by LeicaQ500MC image analysis system. Results  The monoclonal antibody shows specific plasma membrane staining, diffusely on lung carcinoma cells and bronchial epithelial cells, and interspersedly on glandular epithelial cells. Prominent staining was observed in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of lung and their ABCG2 positive units (PU) have the significant difference （P＜ 0.001). ABCG2 was not present in lung cell and small cell lung carcinoma and their PU were approaching zero. ABCG2 PU was higher in the lung tissue around the tumor than all type of lung carcinomas （P＜0.05），and its difference was not significant between the primary carcinoma and the metastatic carcinoma （P＞0.05）.  ABCG2 PU was not involved in the patient?s sex, age, tumor?s metastasis and staging.  （P＞0.05）, and correlated with the differentiation （P＜0.001）. Its PU was decreasing with the histological grading. But the PU difference was not significant between the normal lung tissue and the well differentiated carcinaoma （P＞0.05）. Conclusion  ABCG2 protein expression was involved in the lung carcinogenesis and its differentiation and might help to distinguish cancer from normal tissue and to ascertain the histological grading.

    Key words: lung carcinoma； ABCG2/BCRP/MXR/ABCP； immunohistochemistry； quantitative analysis    ABCG2属ABC转运蛋白家族成员之一，可通过主动转运功能将化疗药物泵出细胞导致化疗耐药的发生。研究还发现在各种来源的干细胞中ABCG2均高表达，认为ABCG2是干细胞标记之一［1］。目前国内外的研究多从定性或定量不定位的角度观察到ABCG2仅在少量正常组织、白血病和包括肺癌在内的一些实体瘤中表达［2,3］， ABCG2在肺癌组织中的原位量化表达特点、变化及意义尚未见报道。本研究拟通过原位检测ABCG2蛋白的表达从定量角度揭示其在肺癌中的表达特点，阐明其与肺癌类型、分化程度、转移和分期的关系，探索其在肺癌中表达的意义。

     1  材料与方法

　1.1  材料     收集南方病理科2005年1月～2006年7月病史资料完整的原发性肺癌手术切除标本(术前未经)86例。其中男性69例，女性17例；患者最小年龄32岁，最大82岁，平均年龄61岁。所有标本经10％福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片（厚度4  μm）、HE染色。根据1999年WHO/IASLC肺和胸膜肿瘤的组织分型，将肺癌分为：腺癌，31例，其中高分化20例，中分化8例，低分化3例；鳞癌，42例，其中高分化5例，中分化11例，低分化26例；大细胞癌，5例；小细胞癌8例。肺癌伴淋巴结转移者33例，肺癌无淋巴结转移者53例。根据美国癌症研究联合会AJCC癌症分期手册（第六版）进行临床病理TNM分期，其中TNMⅠ期50例，Ⅱ期21例，Ⅲ期15例。同时取33例癌周正常肺组织（距肿物5  cm）做为正常对照。

    1.2  免疫组化染色

    免疫组化采用SP法。SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。一抗为鼠抗人BCRP单克隆抗体(克隆号BXP?21)，德国merk公司产品，工作浓度1∶50。用乳腺组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。主要步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，1  mmol/L、PH6.0柠檬酸盐缓冲液微波95℃20分钟，阻断、封闭后，滴加一抗4℃过夜（12小时至16小时）；次日依次加生物素标记的羊抗鼠二抗和Streptavidin?Peraxidase，DAB显色；不复染（用于图像定量分析），脱水、透明、封固，苏木素复染（用于照相）。

    1.3  显微图像定量分析

    根据空白和阳性对照的显色情况，在确定无假阳性和假阴性的前提下，以细胞浆和细胞膜染成棕黄或棕褐色为阳性。用LeicaQ500MC图像分析系统，在40倍物镜下，每个样本随机选取10个视野。对于正常肺，每个视野随机测试20个阳性支气管上皮细胞或腺上皮细胞（数目不足者，测完整张切片）；对于肺癌组织及淋巴结转移癌组织，每个视野随机测试20个阳性癌细胞。每例样本共测试200个阳性细胞，用交互式测试方法测试每个阳性细胞的灰度值为Gβ，同时在相应的10个视野中测试背景灰度值并取其平均值Gα，按下式每个阳性细胞的阳性单位值，本图像分析系统中的Gmax为256。取每个样本中200个阳性细胞值的均值作为此样本表达的阳性单位值（Positive Unit PU）［4～6］。PU值越大，表达强度越高；反之，表达强度越低。PU=|Gα-Gβ|Gmax×100.1.4  统计学分析方法

    用SPSS11.0统计分析软件进行数据处理, 采用两样本t检验和方差分析对数据进行统计分析，以P<0.05表示差异具有显著性, P<0.01表示具有非常显著性。结果部分各表中所列平均值的误差为标准误(s).

    2  结果

    2.1  ABCG2在癌周正常肺组织和不同组织类型肺癌中的表达2.1.1  ABCG2在癌周正常肺组织中表达的细胞定位

    癌周肺组织中ABCG2 基因编码的蛋白主要定位在细胞质和细胞膜，呈棕黄色、弥散分布（图1、图2）。主要表达在支气管和细支气管上皮以及部分浆液腺和黏液腺腺上皮，其中以黏液腺表达更为明显；阳性部位主要在细胞近腔面或基底部；支气管和细支气管上皮细胞表达呈弥漫阳性，浆液或黏液腺上皮细胞呈散在、灶性。癌周正常肺组织的肺泡上皮细胞和肺间质成纤维细胞未见表达，毛细血管内皮细胞偶见阳性表达。

    2.1.2  ABCG2在不同组织类型肺癌中的表达

    肺癌组织中ABCG2 基因编码的蛋白主要定位在细胞质和细胞膜，呈棕黄色、弥散分布（图3、图4）。ABCG2蛋白表达的PU值在肺鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞间总体比较的差异具有极为显著的统计学意义（F=15.86，P＜0.001），其中肺鳞癌和腺癌与各组比较差异均有显著性（P＜0.05）。肺鳞癌和肺腺癌普遍表达ABCG2蛋白， 呈弥漫或大片分布，但表达程度不同，肺腺癌表达的PU值明显高于肺鳞癌（P＜0.001）。肺大细胞癌和肺小细胞癌不表达，PU值接近于零，两者之间比较差异无显著性（P＞0.05），见表1。表1  ABCG2在癌周肺组织和不同类型肺癌中的表达

    2.1.3  ABCG2在癌周正常肺组织和不同组织类型肺癌中表达的比较

    癌周肺组织与各型肺癌相比，ABCG2蛋白表达的PU值分别高于肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌和小细胞癌，差异均有显著性（P＜0.05），见表1。2.2  ABCG2在不同组织类型肺癌淋巴结转移灶中的表达ABCG2在不同组织类型肺癌淋巴结转移灶中的表达特点与原发灶中的表达类似。各型肺癌淋巴结转移灶ABCG2蛋白表达的PU值总体比较差异有显著性（F=7.98，P＜0.05），其中肺鳞癌和腺癌与各组比较差异均有显著性（P＜0.05），大细胞癌和小细胞癌之间比较差异无显著性（P＞0.05）；ABCG2在肺鳞癌和肺腺癌淋巴结转移灶中呈阳性表达，亦呈弥漫或大片分布，但表达程度不同，在肺腺癌转移灶的表达PU值高于肺鳞癌（P＜0.05）。肺大细胞癌和肺小细胞癌淋巴结转移灶中ABCG2不表达，PU值均接近于零，见表2。

    2.3  ABCG2在不同组织类型肺癌原发灶和淋巴结转移灶中表达的比较肺癌原发灶与其淋巴结转移灶相比，ABCG2蛋白表达的PU值差异无显著性（t＝1.98   P＞0.05）。各型肺癌原发灶与其淋巴结转移灶ABCG2蛋白表达的达PU值相比，差异亦无显著性（P＞0.05），见表2。 表2  ABCG2在肺癌原发灶与淋巴结转移灶中的表达注：上标分别表示与其所在组比较差异有显著性，P＜0.05。

    2.4  ABCG2蛋白表达与肺癌患者性别、年龄和癌的分化程度、转移、TNM分期的关系ABCG2蛋白表达的PU值与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期无关，与肺癌分化程度有关（P＜0.001），见表3。分化程度越高，ABCG2蛋白表达PU值越高；分化程度越低，ABCG2蛋白表达PU值越低，差异具有显著性；大细胞癌和小细胞癌属于低分化和未分化癌，PU值接近于零。癌周正常肺组织ABCG2蛋白表达的PU值与高分化肺癌相比无显著性差异（P＞0.05），而与中、低分化肺癌的差异有显著性（P＜0.05）。表3  ABCG2蛋白表达的PU值与性别、年龄和分化、转移、TNM分期的关系

    3  讨论

    ABCG2基因是Doyle等［7］1998年首先从耐药的乳腺癌细胞中克隆出来并引起耐药的基因，故其编码的蛋白又叫乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP）。相继其他研究小组克隆BCRP的cDNA分别命名为MXR (mitoxantrone resistance protein) 和 ABCP (placental ABC protein)。基于它们结构和序列的相似性，又属于ABCG基因家族，人类基因组命名委员会将其统一命名为ABCG2。因此本文统一使用ABCG2。

    目前研究表明ABCG2在正常组织中高表达于胎盘合体滋养层细胞的顶浆面、小肠和结肠上皮细胞的肠腔面、肝细胞膜胆小管面、乳腺导管和小叶以及脑和前列腺。在肺组织中呈低水平特异性表达，主要表达在支气管粘膜上皮层、浆液腺及毛细血管内皮［2,8］。我们观察了距肺癌组织5  cm的周围正常肺组织中ABCG2的表达状况，发现其在支气管上皮和部分浆液腺上皮表达，不仅如此，我们还发现ABCG2在粘液腺上皮也可以观察到明显的阳性表达，但在静脉内皮细胞未见明确表达，毛细血管内皮细胞偶表达。Jonker等［9］发现ABCG2基因敲除小鼠的肠道吸收谱受到明显限制，并且影响到肝胆清除率和胎盘转运。因此认为ABCG2在以上正常组织的表达定位与其本身作为转运蛋白影响肠粘膜的吸收率或药物的生物利用率，肝肾和血浆的清除率有关，它可以泵出细胞内毒物，保护组织免受损伤。本研究发现ABCG2主要表达在细胞的近腔面，提示ABCG2在正常肺组织中的表达可能与保护支气管上皮或腺上皮免受外来刺激损害有关。

    研究表明ABCG2在各种组织源性的肿瘤中广泛表达，并无组织特异性［10］。Diestra等［3］用单克隆抗体BXP?21定性检测150例包括21种类型肿瘤在内的未的实体瘤，发现ABCG2常表达于胃肠道、子宫内膜和肺的腺癌以及黑色素瘤等化疗耐药的肿瘤。本研究应用图像分析系统测试ABCG2蛋白免疫组化显色反应的阳性强度，定量反映ABCG2蛋白的表达强度。结果表明ABCG2蛋白在肺鳞癌和肺腺癌弥漫表达，肺鳞癌表达PU值高于肺腺癌（P＜0.001)，肺大细胞癌和肺小细胞癌不表达，PU值接近于零。癌周正常肺组织表达的PU值高于肺鳞癌、肺腺癌、肺大细胞癌和肺小细胞癌，差异有显著性（P＜0.05）。本研究组在甲状腺转录因子（TTF?1）与肺癌的研究中也发现，TTF?1蛋白表达的PU值在正常成人肺明显高于各种类型肺癌［11］。这意味着正常肺组织在癌变过程中会逐渐失去ABCG2或使其表达受到抑制，而这些标志物含量可能作为临床判断肺癌与正常的一个指标。曾爱华等［12］采用RT?PCR半定量检测到乳腺癌组织中的ABCG2表达要高于癌周组织，与本研究结果相反。我们认为RT?PCR等分子生物学方法检测过程中提取到的是整个组织的RNA或蛋白，无法从原位定位方面准确反映肿瘤或正常组织实质细胞中ABCG2的表达情况，我们通过免疫组化原位定量获得目的细胞的阳性表达值，从原位实际地反映出细胞中ABCG2的表达强度。

    ABCG2最早是作为耐药蛋白从肿瘤细胞中分离出来的，因此ABCG2与肺癌耐药的关系备受关注。长期的临床工作实践提示“高、中分化肺癌对化疗耐药，低分化及未分化肺癌对化疗敏感”。Yoh K等［13］的研究结果也发现，ABCG2阳性非小细胞肺癌患者化疗有效率低于ABCG2阴性患者病例。我们的分析发现，肺癌中ABCG2蛋白表达地PU值与肺癌分化程度有关（P＜0.001），随着肺癌分化程度的降低ABCG2表达的PU值逐渐减弱，低分化腺癌和低分化鳞癌呈不表达或极弱表达状态。大细胞癌和小细胞癌均不表达，PU值接近于零。因此根据Yoh K的临床治疗结果和我们的病研究结果，我们认为ABCG2蛋白在肺癌中的表达一方面可以作为判断肿瘤分化程度的指标，另一方面也可能成为预测化疗效果的指标之一。笔者还注意到ABCG2蛋白与肺癌患者性别、年龄及癌的转移、TNM分期均无明显相关性（P＞0.05），各型肺癌原发灶和淋巴结转移灶ABCG2蛋白表达PU值比较，差异也无显著性（t＝1.98，P＞0.05），这进一步突显了ABCG2的表达与肺癌分化的关系。

【】
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